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(無題) 削除/引用 No.724-8 - 2008/03/01 (土) 11:39:37 - おお 一つはもっとたくさんの目的のキナーゼを回収することで、バックグランド(非特異な活性)より強い活性を得ることが必要かと思います。過剰発現系を使ってみればと思いますが、そういう実験系を組んでなさそうなので、何か理由があるのかなという気もしますが、、、内在性の活性を見たいということかもしれませんが、、 COSや293TなどT-antigen発現細胞にSV40oriを含む発現ベクターで強制発現してみればどうでしょうか?或いはバキュロを使うとか。 反応は37度でしょうか?30度で非特異を下げるというのを聞いたことがあります。ダメもとで25度でも可能性があるかもしれません。 検出は32Pでしょうか?最適なATP濃度を探る必要がありますし、場合によっては90%がコールドのATPであっても検出できるはずです。 基質について触れていませんがペプチドでしょうか?いずれにせよ非特異が出にくい設計も必要かもしれません。何かリコンビナントであれば、期待する場所を含むN末、C末を使ってみるとか。 おそらく細胞か組織のライセートと思いますが、ライセートの調整方法も工夫する手があると思います。サイトゾルのものなら、核や細胞膜フラクションを除くとかそうすると、コンタミの活性を幾らかでも防げるはずです。 或いはそのキナーゼがチロシンキナーゼであれば、セリンスレオニンキナーゼに作用するインヒビターとか試してみてもいいのかもしれません。 ビーズのせんじょうは一般論としていろいろあります、デタージェントなどをつかうとか、高い塩濃度を使用するとかです。場合によっては500mMぐらいのKClかLiClが有効かもしれません。LiClは弱いカオトロピック作用があります。キナーゼアッセイも高い塩濃度とかデタージェントを使うことで基質と非特異的なキナーゼの接触を抑えれるかもしれませんので、これも考慮に入れても良いかと思います。 私は極力ビーズの量を減らします。１度ビーズによって回収できる抗体量、それから期待できるタンパクの量を計算してみてください。標準のプロトコールではもう要らないと言うほど取れることが分かります。ビーズの量におおじてノンスペを拾うなら、ビーズを減らした方がいいと思うわけです。 あと、目的のタンパクをビーズからはがしてからアッセイするとか、ビーズで反応させたあと、上清、ビーズについたフラクションを高い塩濃度とかで基質をはがしたフラクション、酸とかで抗体からリリースさせたフラクションなどためして、特異的反応がどこに見られるかと言うのもアイデアかと思います。 もし新規、或いはだれも活性を測ったことがないようなものであれば、１度なるべく精製されたものを得て、酵素の特性を探ってからのほうが、アプローチしやすいです。

(無題) 削除/引用 No.724-7 - 2008/02/27 (水) 18:12:36 - ＩＰ 書かれておられるように、ビーズ自体への結合の他に、抗体やビーズとのincubation中にlysateが凝集して非特異的に、IgG-ProteinA複合体がトラップされて、一見、抗原に結合したような印象を与えることがあります。 これらを防ぐには、たいへん古典的ですがProteinASepharose6MBのような、大きな直径のビーズを使ったり（凝集体はビーズ中には入れない）、incubation時間を短くする（ビーズと混ぜるのを２０分程度にする）、方法があります。 もちろん、ProteinA自体がターゲットとされてる事もあり得ますが、それなら２次抗体を使うとか、ProteinGを使う、等も可能かもしれません。ただ、ともかく、それが非特異的だとわかれば、じゃまにならなければ特に無理して除く必要もないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.724-6 - 2008/02/27 (水) 13:22:40 - ごんべ ビーズをブロッキングすると場合によってはかなり改善します。

(無題) 削除/引用 No.724-5 - 2008/02/27 (水) 09:55:32 - 名無し protein Aにくっ付いてるのか、ビーズにくっついているのか分からないので、protein A 良くないみたいに判断するのはまだちょっと早いと思いますが、もしProtein AがよくなさそうならProtein G-beadsにしてみることはできます。ビーズが悪そうなら別の材質のビーズに変えるとかするといいかもしれません。また蛋白質を共有結合する担体はいろいろあるのでそういうのに抗体を直接くっつけて使うことも出来ます。（最近は非特異的吸着が少ないですみたいなことが書いてあるのも出てるとおもうから、代理店の人とかメーカーの人に聞くとかしてそういうのを探すのもいいと思う。）免疫沈降前に１段階簡単な精製ステップをいれて、うまいこと非特異的なkinaseを除くのも一つの方法です。

(無題) 削除/引用 No.724-4 - 2008/02/26 (火) 23:09:40 - L その後、kinase assay　を進めて根本的な問題にぶつかりました。 ProteinA でプレクリーニングしたライセートに、抗体を入れずに、 Protein A-beads を用いてメンチンと同様な操作をしたのですが、 これにより得られた沈降物が、抗体を入れた時と同じkinase 活性を持ってました。 つまり、検出されているリン酸化バンドは、Protein A に非特異的に結合 したkinase由来であると思われます。 ライセートを超遠心して試してみましたが、結果は同じでした。 ProteinA への非特異的な結合を根絶する良い方法は無いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.724-3 - 2008/02/25 (月) 16:05:50 - 名無し 免疫沈降では、抗体はうまく働いて取りたい蛋白質がちゃんと捉えられている時でも、関係ない蛋白質も非特異的に抗体とかビーズとかにくっついたり、中途半端に溶けているものとかが遠心したときいっしょに沈殿したりするから、いっぱいバンドが見えて、見た目コントロールと大差ないことは普通。その中にkinase活性が混じっていればそうなるかもしれない。あと、もともと量的にかなり多い蛋白質でないと、WBでははっきり見えていてもクマシー染色では非特異的に混じった蛋白質に隠れてバンドとして認識できないと思う。よく言われるように、normal IgGプラスProtein G/A beadsでプレクリーニングして、よく遠心して不溶物を除いてきれいになったライセートで免疫沈降をすると、ある程度は（ものすごく期待するほどでないけど）改善する。ビーズを遠心によらずに回収できる磁気ビーズみたいなのを使うのも、抗体反応の途中で不溶化したものを撒き込まないという点でいいと思う。免疫沈降のまえにもう１段階簡単な精製（ゲル濾過とか、硫安分画とか）をして得た部分精製品を免疫沈降に使うといいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.724-2 - 2008/02/23 (土) 10:06:08 - mimi ゆるい界面活性剤(Brij,saponinなど)を加える。 塩濃度を上げる。 プレクリーンのビーズやIgGを増やす。 ライセートのローディング量を減らす。 　 　 　 抗体の特異性を疑う・・・ 好感度トータルタンパク質染色試薬で免沈の結果を評価してください。 Westernに使える抗体がIPに使えるとはらない。

めんちん 削除/引用 No.724-1 - 2008/02/22 (金) 20:43:05 - L 現在、自作抗体（抗原カラムで精製済）で免疫沈降⇒kinase assay を試みています。 目的蛋白質を落とす事に成功していることは、 ウェスタン解析で確認しています。 尚、このとき、コントーロールIgGでは落ちてきません。 しかし、実際にkinase assay を行うと、 コントロールIgGでも同様なkinase 活性が検出されてしまい、困っています。 試しに、免疫沈降物をSDS-PAGEした所、 インプットに比べて、なくなっているバンドはありますが、 ほぼ全体的に（非特異的に）沈降されてしまっている様です。 バンドパターンもほぼコントーロールIgGと変わりありません。 今後は、洗浄を厳しくする等が考えられますが この様な場合の対処法（バックを低減する方法）を 教えて頂けないでしょうか？ 尚、ビーズの洗浄は下記の物を使用しています。 20 mM Hepes-KOH, pH7.5 150 mM NaCl 1 mM EDTA 20 mM β-glycerophosphate 5 mM EGTA 1 mM dithiothreitol Protease inhibitor

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