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GST融合タンパク質のCleavage 削除/引用 No.722-12 - 2008/02/23 (土) 19:09:58 - GSTまいった どうやら切断後の目的タンパク質のCBB染色,銀染色での染色性が極端に悪いようです。ウェスタンを行ってみたところ、かなりの濃度で切断された目的タンパク質が処理液に入っていることがわかりました。 ご助言、ご意見ありがとうございました。

GST融合タンパク質のCleavage 削除/引用 No.722-11 - 2008/02/23 (土) 10:36:21 - GSTまいった 皆様 ご意見ありがとうございます。 融合タンパク質は1-3mg/mLほど取れており、切断されたGSTもバンドの濃さから考えると同等量ありそうです。しかしながら、皆様がおっしゃるような沈殿は一切見えません、とてもクリアな液体です。ですので、不溶化しているとは考えづらく、チューブなどに吸着している、または染まり方が極端に悪いという可能性が高いのかなと考えています。 一度ウェスタンを試してみて、後者の可能性を検証してみることにします。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.722-10 - 2008/02/23 (土) 09:53:29 - mimi 補足です。 >オンカラムで切断後サンプルバッファーで溶出してみると良いと思います。 プロテアーゼ切断液でタンパク質をカラムから溶出した後、 カラムをサンプルバッファーで処理・溶出すること。 >オンカラム切断ではなくて、一度グルタチオンで溶出してから切断してみる タンパク量が十分あれば、不溶性になると目視で判断できますし、ペレットに しても分かります。もし、水溶性のままならグルタチオンを透析除去して 次のステップに、持って行けば宜しいと思います。またこの場合では、純度が 多少落ちますが、ビーズに対する切断後タンパク質の吸着とカラムに対する吸 着によるロスは防げます。

(無題) 削除/引用 No.722-9 - 2008/02/23 (土) 09:37:48 - mimi ＧＳＴのみのバンドが見えてるなら、切れていると考えるのが妥当でしょう。 オンカラム切断ではなくて、一度グルタチオンで溶出してから切断してみる か、オンカラムで切断後サンプルバッファーで溶出してみると良いと思います。 ほかの方がご指摘のように切断後不溶化・沈殿することが、良くあります。

(無題) 削除/引用 No.722-8 - 2008/02/23 (土) 09:35:22 - 標準 >切断後の上清、およびGlutathioneアガロース精製後のサンプルを確認しました。どちらも同じ状態で異常に少なくなっています。チューブとかにくっつくんですかね？チューブをBSA処理とかすれば少しはましになるのでしょうか？？ Glutathioneアガロース精製後のサンプルを切断し、そこにダイレクトに、ＳＤＳローディング液を加えたという意味と仮定します。 その場合、チューブにくっついたもの１、Glutathioneアガロースにくっついたもの２、切断後の不溶性になったもの３、すべてがＳＤＳローディング液で可溶化できるはずです（可能性が高い）。ＳＤＳローディング液で、inclusion bodyが可溶化できるのですから。 よって、チューブをBSA処理してもだめでしょう。（ダメの可能性が高い）。 目的蛋白の抗体があるなら、ウエスタンで、切断プラス、マイナスをダイレクトに、ＳＤＳローディング液に溶かせば、結論がほぼ得られますね。たぶん。

(無題) 削除/引用 No.722-7 - 2008/02/23 (土) 02:35:56 - A XaのサイトがないといってもArgかLysのあるところでは実際の 特異的サイトよりも切れにくいというだけで全く切れないと 考えるのは危険かと思います。 ただここまで聞いた感じではななしさんが指摘されているように 目的の14kDaの蛋白質はGSTの安定性に引きずられて可溶化されて いるだけなのでしょう。ですから切り出された目的蛋白質の大部分は 沈殿したのでは？

(無題) 削除/引用 No.722-6 - 2008/02/23 (土) 00:34:26 - ななし GST-fusionタンパク質は、GSTとfusionになっている状態では 可溶化の状態でも、プロテアーゼで切断すると不溶化してしまうことが よくあります。 プロテアーゼできったあと、沈殿ができていなかったか確認しましたか？

(無題) 削除/引用 No.722-5 - 2008/02/22 (金) 22:04:16 - GSTまいった ともさん やはり染まりにくいタンパク質というのがあるのですね。 今回質問しているタンパク質を２社のCBB染色液で染めたことがあるのですが、明らかに染まり方が違ったのでもしかして、銀染色でもそういったことがあるのかと考えていました。一度Westernしてみることにします。ありがとうございます。 TSさん 切断サイトがないことは確認しています。そこまで素人ではありませし、うっすらとでも目的バンドが見えている時点でその可能性は低いですよね。 標準さん 切断後の上清、およびGlutathioneアガロース精製後のサンプルを確認しました。どちらも同じ状態で異常に少なくなっています。チューブとかにくっつくんですかね？チューブをBSA処理とかすれば少しはましになるのでしょうか？？ リコンビナントタンパク質はやればやるほど、あらたなもんだいが出てきますね。引き続きご意見いただければと思います。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.722-4 - 2008/02/22 (金) 21:52:58 - 標準 ありますね〜〜〜。私も不思議でたまりません！ 普通でも、なんと１０分の１くらいに目的蛋白がなります。私はＸａを使っています。 チューブやレジンにくっついている可能性がありますので、切断反応液をそのままＳＤＳローディング液で処理するか、上清のみを取ってきたか（そのときビーズ部分もチェック）で変わってくるかもしれません。一度チェックしてみるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.722-3 - 2008/02/22 (金) 19:15:07 - TS 目的のタンパク質にプロテアーゼの認識部位がないことを確認しているのでしょうか？いっしょに切れちゃったりしてませんか？

(無題) 削除/引用 No.722-2 - 2008/02/22 (金) 17:35:36 - とも 銀染色は使用するメーカーとタンパクの種類によって検出感度ってかなり違います。 例えばA社の銀染色でAというタンパクを染めると見えるけど、B社の銀染色でAというタンパクを染めても見えないということがあります。 量が十分あっても染まらないっていうことは何度か経験しました。 その場合はウエスタンでバンドを確認しています。 GSTの抗体と染めたいタンパクの抗体両方使ってやっています。 一度ウエスタンやってみては？？ あとプレシジョンの反応は大丈夫ですか？？ バッファーコンディションや濃度、時間など。 プロトコールよりも若干長めに反応させるとよいですよ。 ４度でO/Nやっています。 あとプロテアーゼインヒビターを入れたりはしないでください。

GST融合タンパク質のCleavage 削除/引用 No.722-1 - 2008/02/22 (金) 17:02:04 - GSTまいった いつも参考にさせていただいています。 GST融合タンパク質を作成し、Glutathioneアガロースを使ってCBBでシングルバンドになるまで精製しました。ベクターはpGEX6P-1を使用し、目的タンパク質は約14kDでGST融合タンパク質は約40kDです。目的の遺伝子がきちんと組み込まれているのはシーケンスで確認しました。 タンパク質濃度は十分得ることができたので、目的のタンパク質を得るため、PreScission Proteaseを使用してGSTと目的タンパク質を切断しました。 切断後のサンプルを泳動すると(Glutathioneアガロースによる精製前）、PreScission Protease 46kD、切断しきれなかった融合タンパク質40kD（切断前よりも明らかに薄くなっています）、切断されたGST 27kDが確認されました。 しかし、融合タンパク質から切断されたはずの目的タンパク質のバンドが見あたりません。銀染色をしたところ非常に薄いバンドが14kDの位置に確認できました。 切断前の融合タンパク質のバンドの濃さ、切断されたGSTのバンドの濃さに比べて目的タンパク質のバンドの濃さが極めて薄いのですが（視覚的には30-50分の1ほど）、目的のタンパク質はどこに行ってしまったのでしょう？融合タンパク質はGSTと目的タンパク質と等モルで切断されるはずなので、目的タンパク質が14kDであることを考慮しても薄すぎる気がします。 皆様こういったご経験はございますでしょうか？是非ご意見をお聞かせ下さい。

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