全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.720-12 - 2008/02/25 (月) 19:48:24 - コロ助 ＞Oさん ありがとうございます。かなりテクニカルな方法ですけれども、一度やってみる価値があります。 いろいろと試してみることにします。

(無題) 削除/引用 No.720-11 - 2008/02/25 (月) 18:22:05 - O 私も浮遊細胞の蛍光抗体法を行っていたことがあるので参考までに。 最終的にはサイトスピンに落ち着いたのですが、それまでに試した方法を挙げておきます。 １．浮遊液を遠心後、上清を取り除いた後にOCTコンパウンドを入れてゆっくりピペッティング。そのcell suspennsionを凍結切片作成用のウェルに入れて凍結し、切片を作成する。 かなりトリッキーな方法だと思います。浮遊細胞の電顕切片を作る方法を参考にして編み出してみましたが、細胞の形も保たれて思った以上に綺麗に染色できていました。 ２．固定、染色は浮遊状態で行い封入は12wellや24well plateに細胞と多めの封入剤（蛍光用の固まらないタイプ）を入れて観察する。保存の際は乾燥と遮光に気をつければ4℃でしばらく大丈夫です。もし共焦点などで観察したい場合、底面がガラスになっている3センチディッシュなどを用いればかなり綺麗に見えるかと思います。 ただこの場合、封入は特に問題がないですが、染色の工程でいちいち細胞を回収しなければいけない手間の方が大きかったです。

(無題) 削除/引用 No.720-10 - 2008/02/24 (日) 16:36:44 - コロ助 ＞仕事中さん アドバイスありがとうございます。私の研究が細胞と細胞外マトリックスとの相互作用の研究なので、ポリリジンとかが細胞に変なシグナルを与えないかどうかという危惧するところが少しあるんです。 でも、試してみる価値はありますね。 ありがとうございます。やってみます。

(無題) 削除/引用 No.720-9 - 2008/02/23 (土) 14:09:20 - 仕事中 Poly-L-Lysinなどで処理した細胞付着性の高いスライドグラス上で一晩培養してから固定、染色ではダメなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.720-8 - 2008/02/22 (金) 20:19:13 - コロ助 ＞IFさん 貴重なご意見ありがとうございます。参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.720-7 - 2008/02/22 (金) 19:00:45 - IF > 固定という方法もあるのかと思います。 →固定という方法もあるかと思います。 失礼しました

(無題) 削除/引用 No.720-6 - 2008/02/22 (金) 18:53:41 - IF poly L lysine処理したスライドグラスあるいはカバーグラスに細胞を付着させ、固定という方法もあるのかと思います。プロトコールは、Cold Spring Harbor Lab のUsing Antibodies, A laboratory manual を参照するのがよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.720-5 - 2008/02/22 (金) 14:36:45 - コロ助 ＞blotさん なるほど。とても参考になります。 詳細に条件も書かずにトピをあげてしまってすみませんでした。 「比較的高濃度の細胞浮遊液を調製後、塗布、乾燥後、所定の固定液で処理を行う」という操作において、細胞浮遊液を塗布、乾燥させても細胞のタンパク質の局在とかに影響は出ないのでしょうか？ たびたび質問してしまいましてすみません。

(無題) 削除/引用 No.720-4 - 2008/02/22 (金) 14:26:22 - blot ＞浮遊状態で固定・染色を行い、観察時にスライドグラスに封入 なるほど。そうでしたか。染色時の方法が示されていなかったので、最初にスライドグラスに固定後の染色と思っていました。 フローサイト以外の時は、最初からスライドグラスに固定して染色をしています。で、その際の固定方法はサイトスピンがなければ、ない方法で行うしかありません。 比較的高濃度の細胞浮遊液を調製後、塗布、乾燥後、所定の固定液で処理を行う、、、と言う、通常のやり方です。見たい抗原が有る無しなら、メタノールなどで、構造をほどほど保ちたければパラフォルムアルデヒドで、膜タンパクなら、それ用の固定液を適時選択します。これらは、いくらでも良著が出回っていると思うので、書く必要もないと思いますが。 >染色の後にマウント剤に混ぜてスライドグラスを作製 ん〜。多分それではうまく行かない可能性があります。仮に封入はできたとしても、共焦点でさえも良い画像がとれるか分かりませんよ。細胞密度が薄く、一個の細胞だけの検鏡なら使えるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.720-3 - 2008/02/22 (金) 14:06:06 - コロ助 ＞blotさん うちの研究室にはサイトスピンがないので、浮遊状態で固定・染色を行い、観察時にスライドグラスに封入しようと思っています。 その浮遊状態から封入する際に、どうやってマウントするのが適切かわからなかったので質問させていただきました。 染色の後にマウント剤に混ぜてスライドグラスを作製すればよいのでしょうか？ blotさんはどのように行っていますか？

(無題) 削除/引用 No.720-2 - 2008/02/22 (金) 13:40:14 - blot 参考にできるプロトコールは知りませんが、封入はアドヘレントと同じです。変える必要に迫られた事がないのですが、変える必要があるとすれば、どのような事（時）でしょうか？ 逆に質問してすみませんが、教授のほどをお願いします。

浮遊細胞での蛍光抗体法 削除/引用 No.720-1 - 2008/02/22 (金) 11:14:51 - コロ助 いつも参考にさせていただいてます。 実験を進める中で、今回浮遊細胞で蛍光抗体法を行いたいと思っているのですが、あまりプロトコールなどが出回っていませんでした。 どなたか参考になるプロトコールをご存知ではないでしょうか？ 特に、封入する際にどうしたらよいのか悩んでいます。 ご教授お願いします。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---