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competent cellを別の菌種に変えてみる 削除/引用 No.716-4 - 2008/06/29 (日) 23:05:55 - ccatgg 　かつてβアクチンプロモーターのプラスミド、PQE-Trisystemで似たトラブルを経験しました。 その時は、DH5αからXL-10Gold(Stratagene)に切り替えると、プラスミドがとれるようになったのでβアクチンプロモーターとDH5αの相性が悪いのではなかったかと、想像していました。 　まあ、pQE-Trisystemは大腸菌、バキュロウイルス、哺乳類、３つの系のプロモーターを持つベクターなので、DH5αでは多少リーキーに蛋白を作ってしまうことが原因だったかも知れません。 　超化石レスですが参考まで。

(無題) 削除/引用 No.716-3 - 2008/02/22 (金) 19:31:51 - AP これまでもここで何度も論議されていたように、切り出しのとき、不用意にUVを当てまくっているのではないですか？ ＞pCAGGSベクターにライゲーションされない のではなく、UV照射によって生じたピリミジンダイマーのために、できたプラスミドが大腸菌に導入されても複製不能であるためだとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.716-2 - 2008/02/22 (金) 12:14:41 - ~ 昔いたラボで使われていましたが、特にこのベクターだからという問題は生じませんでした。 そのため、ベクター自体が問題ではないと思います。 インサートやベクターの切り出し精製か、ライゲーション辺りに問題があるような気がします。 適当なEcoRI,NotIフラグメント(長さが同じくらいのもの) pBS-EcoRI,NotI を用意して、それぞれの組み合わせでライゲーションしてみてはいかがでしょうか。

pCAGGSベクターにライゲーションされない 削除/引用 No.716-1 - 2008/02/21 (木) 16:21:44 - Ｄ ある遺伝子をpCAGGSベクターにライゲーションしているのですが、 DH5αにトランスフォーメーション後のコロニーが全く生えません。 インサーとはpBluescriptにクローニングした遺伝子をEcoRI,NotIで 切り出したものを、 multi cloning siteを組み込んで改変したpCAGGSのEcoRI, NotIに 組み込もうとしています。 ClaIとNotIでやろうとしても上手くいきません。 EcoRI, NotIもしくはClaI,NotIのダブルdigestionは上手く いっているのを電気泳動で確認しています。 この遺伝子は、pcDNA3.1やpHbetaなどにはライゲーションできるので、遺伝子の毒性が原因ではないと思います。 何らかの原因と解決法をご存知でしたら、ご教授下さい。

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