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(無題) 削除/引用 No.714-5 - 2008/02/23 (土) 10:12:59 - mRNA みなさんありがとうございました。いろいろなことが分かり助かりました。

(無題) 削除/引用 No.714-4 - 2008/02/22 (金) 14:44:08 - BPB paralogがkeypointならばそばさんの意見に賛成です。RNAの量が確保できるようでしたらRNase protection assay (RPA)が良いかと、そうでなければTaqManを用いたqPCRになると思いますが、個人的にはRPAがお勧めです（TaqManでもダメな時があった）。

(無題) 削除/引用 No.714-3 - 2008/02/22 (金) 12:15:10 - そば >そのサイズが300bpくらいでとても短いのです。 いや、全然短くないです。十分な長さがあると思いますよ。 >40〜60pbくらいの長さのプローブになりました。 ”ハイブリダイズする領域が40〜60pbくらいの長さ”なんですよね。条件を多少検討する必要があるかもしれませんが、十分可能だと思います。 >こういうケースでは他の方法、例えば定量的RTPCRとかのほうが良いのでしょうか。 基本的にノザンは定量性とRNAのサイズ情報が知りたい時に使います。 より正確な定量性を求めたいならRT-PCRの方が良いですね。使用するRNAも少なくて済みますし。 特異性を求めたいなら、hybridization probeを用いたRT-PCRやRNase protection assayなども選択肢として考えられます。 ちなみに。 文章を見てると、無理にノザンをやる必要は無いような気がするのですが。 ラボの設備等によってもお勧め出来る選択肢が変わり得るので、まずはラボでRNA定量をやっている方に相談すると良いと思いますよ。長さに関しては情報として伝えた方が良いですが、問題になるようなサイズではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.714-2 - 2008/02/21 (木) 12:40:42 - やまさき それくらいの短いプローブでノザンということであればもちろんRIが無難というかnon-Riではかなりうまいヒトでないと無理かと。ラベリングも5末端では厳しく、nick translationもうーんって感じですね。ランダムラベルは短い（200塩基以下）断片では極端にラベル効率が悪くなると言われていますので、あえて言えばIVTでしょうか？ ortholog(paralogですよね、definition確認してください。）で似たのがあるとのことですが、似ているといっても核酸で80％くらいなら洗浄のstriengencyで何とかなるのでは？と思います。 ということでしっかりした長さのプローブを作って厳しめの条件で洗浄（条件検討必要）が良いのではと思います。

短いmRNAの定量について 削除/引用 No.714-1 - 2008/02/21 (木) 12:00:34 - mRNA 動物組織のある遺伝子のmRNAの発現量をノーザンブロットで調べたいと思っています。ただそのサイズが300bpくらいでとても短いのです。オーソローグで配列のよく似た遺伝子があるので、それらを判別できるように、できるだけ似ていない部分の配列でプローブを設計してみたところ、40〜60pbくらいの長さのプローブになりました。この遺伝子でノーザンやっている論文が１つあったのですがシグナルがほとんど見えず、ネットとか見ても800pbでもかなり短かいみたいなことが書いてあり、プローブも普通数百bpは必要とか書いてあるのがあり、通常のノーザンで調べるのが適切かどうか分かりません。こういうケースでは他の方法、例えば定量的RTPCRとかのほうが良いのでしょうか。小さいmRNAの発現量の定量をした経験のある方いましたら教えて下さい。

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