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(無題) 削除/引用 No.710-5 - 2008/02/21 (木) 17:51:50 - NF 皆さん お返事ありがとうございます。 私が予想していた可能性も十分考えられるということですね。レポータージーンアッセイは間接的な証明であり、直接的な証明が必要ということですね。

(無題) 削除/引用 No.710-4 - 2008/02/21 (木) 12:42:34 - GAL つまり直接なのか間接なのかは、 という文章は無視して下さい。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.710-3 - 2008/02/21 (木) 12:41:02 - GAL >もしAとBをco-transfectionして、ルシフェラーゼの発現が上昇した場合、転写因子Bがダイレクト>にプロモーターAに作用していると考えるものなのでしょうか？ つまり直接なのか間接なのかは、やまさきさんがおっしゃるようにプロモーターに変異や欠損したもので試すと良いと思います。 ちなみに、転写因子Bに対するsiRNAでやるという手もあります（四月からほとんど全部のメーカーが値上げするそうですから今のうちに購入しておいた方がいいかも）。 もちろんこの後EMSAは要求されるでしょう、それはまた後で。

(無題) 削除/引用 No.710-2 - 2008/02/21 (木) 11:49:28 - やまさき co-transfectする場合は確かにその可能性がありますね。それでは内因性に目的のプロモータをシス制御する転写因子が出ていると思われる細胞を使っていろいろなデリーションミュータントのレポータープラスミドだけをtransfectしたら良いのでは？またご存知と思いますがゲルシフトも直接の結合を示唆するデータが取れますよ。

レポータージーンアッセイ 削除/引用 No.710-1 - 2008/02/20 (水) 17:45:45 - NF 今回、レポータージーンアッセイを行おうと思います。 ルシフェラーゼ遺伝子の上流に興味のあるプロモーター領域Aを挿入し、プラスミドを作成しました（プラスミドA）。このプロモーター領域Aに結合するかもしれない転写因子Bを発現するプラスミドも作成しました（プラスミドB）。 AとBをco-transfectionしてルシフェラーゼの発現変化を見ようと思っているのですが、素朴な疑問が出てきました。 もしAとBをco-transfectionして、ルシフェラーゼの発現が上昇した場合、転写因子BがダイレクトにプロモーターAに作用していると考えるものなのでしょうか？たとえば、転写因子Bがゲノム上のある転写因子Xの発現を上昇させ、その転写因子XがプロモーターAに作用していると考えることも出来ると思います。 皆さんはどういった解釈で実験を進めておられるのでしょうか？ 上記のような可能性を考えると、最終的にはプロモーター領域A上の転写因子B結合領域を推測して、その後in vitroでその転写因子B結合領域と転写因子Bが直接結合することを示すといった流れで研究を進めていくのでしょうか？ 初歩的な質問ですが、どなたかご意見お聞かせください。

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