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(無題) 削除/引用 No.71-7 - 2010/06/16 (水) 23:33:00 - allen すみません。新たにトピックをつくろうと思いましたが、間違ってここに投稿してしまいました。申し訳ありませんでした。

pSMARTやpBLUESCRIPTに関して 削除/引用 No.71-6 - 2010/06/16 (水) 16:41:57 - allen 　いつもお世話になってます。 　サブクローニングしようと思っていますが、pSMARTとpBLUESCRIPT、どちらを選ぶかがわかりません。 　判断基準などについて、詳しい方に教えていただきたいです。 　 　後、両方のメリット、デメリットはなんでしょうか。どちらが常用で、使いやすいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.71-5 - 2007/08/17 (金) 13:43:36 - パンタ >有る程度のレベルのjournal以上になるとGFPなどの与える影響については >少なくてもsupplementなどでendoの分子と比較したdataなどは >要求されることが多いですし、少なくとも調べるべきポイントでしょうね。 なるほど、やはり要求される場合が多いのですね。 >内因性の分子で解析する場合、基本的に機能解析でも局在などでもあまりクリアにデータが出ないことが意外とよくあるので、tagつきので過剰発現などしておおまかな検討をつけておけば内因性のでやってデータが弱くても互いに補強しあえると思います。 冷静に実験を組み立ててあげれば、他人を納得させられるデータとなりますね。言われたり読んだりすると、なるほどね、と思うんですが、自分で組み立てるとなると、冷静さが失われて、、、 少し話が逸れてしまいましたが、GFPを融合タンパク質として発現するときは慎重に準備、解析をしなければならないものだと認識しておきます。 一応解決といたしますが、私はこう思う、などのご意見があればよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.71-4 - 2007/08/17 (金) 12:29:01 - 通りすがり >あんまりみんな使ってるので、その前段階、つまりGFPによる影響が少ないこと >は十分議論されているのでしょうか。 結局はjournalやレフリーなどのレベルに左右されるものだと思います。 論文や実験の信頼性において大事な点ですからね。 有る程度のレベルのjournal以上になるとGFPなどの与える影響については 少なくてもsupplementなどでendoの分子と比較したdataなどは 要求されることが多いですし、少なくとも調べるべきポイントでしょうね。 >これからやろうとしてるのは、機能がほとんど未知なので、GFPをつける前によ >り小さなタグ（FLAGなどのペプチドタグ）で見たほうがよいのでしょうか？本来 >ならば抗体を作製すべきなのでしょうけど、、、 個人的には同じような場面であればFLAGとかHAのほうが最初に選択しますね。 GFPを使うメリットがあるのは生細胞で見る必要がある実験か 抗原がマスクされたりして通常の免疫染色法などでは正しい局在が調べられないような可能性のある場合に限られます。それ以外なら低分子のタグのほうが良いでしょう。 >抗体のない、あるいは低発現のため抗体では検出できないタンパク質に対して >は、どのような戦略が取られているのでしょうか？前者に対してはタグをつけ >て解決できると思いますが、後者の場合は過剰発現して、、、になるのでしょ >うか？ ある未知の因子を見つけたりした時点で抗体が無いか発現量が少なくて 適切な抗体がない場合、自分の場合は実際的な戦略として、 抗体作成を行いながらできるまでの期間(数ヶ月)の間に低分子のタグをつけたもので局在や機能を調べておき、それでまずデータをとり、抗体ができたころに内因性ので最終確認するという風な戦略でやりますね。 内因性の分子で解析する場合、基本的に機能解析でも局在などでもあまりクリアにデータが出ないことが意外とよくあるので、tagつきので過剰発現などしておおまかな検討をつけておけば内因性のでやってデータが弱くても互いに補強しあえると思います。 その上でもしも生細胞などでダイナミックな分子挙動などが期待される場合は GFPを使うというステップに進むと良いと思います。その場合、endoやsmall tagで有る程度機能や局在の正常時に近いdataが得られているのでGFPをつけた場合の影響も比較できるので自分でも安心して実験できるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.71-3 - 2007/08/17 (金) 10:59:05 - パンタ 通りすがりさん、丁寧なご回答ありがとうございます。 >あります、何回も。いや何十回もかな? >酵素などにつけたときは >多かれ少なかれ影響はでるのが普通だと考えたほうがいいです。 う〜ん、あるとは思っていましたが、ここまでとは、、、認識が甘かったと実感いたしました。あんまりみんな使ってるので、その前段階、つまりGFPによる影響が少ないことは十分議論されているのでしょうか。 >余計おかしくなる場合ももちろんあるし未知のタンパクなどはやってみるま>でわかりませんからね。 >とりあえずはN末端とC末端につけたコンストラクトを両方作ってみてどちら>がendoの分子の局在や活性などに近いかcheckすべきです。 これからやろうとしてるのは、機能がほとんど未知なので、GFPをつける前により小さなタグ（FLAGなどのペプチドタグ）で見たほうがよいのでしょうか？本来ならば抗体を作製すべきなのでしょうけど、、、 重ねての質問で申し訳ないのですが、抗体のない、あるいは低発現のため抗体では検出できないタンパク質に対しては、どのような戦略が取られているのでしょうか？　前者に対してはタグをつけて解決できると思いますが、後者の場合は過剰発現して、、、になるのでしょうか？ 初歩的な質問ばかりで恥ずかしいのですが、様々なバックグラウンドの方からの意見をいただけたら幸いです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.71-2 - 2007/08/17 (金) 10:15:35 - 通りすがり >GFPをつけた時とつけないときで、挙動が変わってしまった報告、あるいは経験 >などはあるでしょうか？GFPが影響を与えにくいとは言っても、ある機能がマス >クされてしまったりしないのでしょうか？　 あります、何回も。いや何十回もかな? 酵素などにつけたときは 多かれ少なかれ影響はでるのが普通だと考えたほうがいいです。 GFPにつなげたらdominant negativeに機能するようになってしまい 内因性の分子の機能阻害をするようなってしまった例もあるぐらいなので。 >また、逆にGFPが影響を与えないようにするための工夫（例えば目的タンパク質 >とGFPの間にスペーサー配列を入れるなど）はあるのでしょうか？ 使っているGFPがオリジナルのものかどうかわかりませんが、いわゆる最も普及しているタイプのEGFPやvitrogenのEmeraldなどは、高発現したときにdimerやaggregateを作ってしまい局在や分子機能がおかしくなることがあります、この場合はGFPそのものに変異を入れたりすることでmonomer typeのGFPにしたり、いくつかの会社から販売されているGFPと波長が類似した蛍光タンパクにシフトすることで回避できます。 次にGFPがN末端やC末端に融合させた分子の機能に影響する可能性はまず自分の興味のある分子そのものやファミリー分子などの機能解析からN末端やC末端のどちらのほうに機能ドメインがあるか調べてその逆側のほうにGFPをつけるように工夫すれば防げる可能性は多少高まりますが、 余計おかしくなる場合ももちろんあるし未知のタンパクなどはやってみるまで わかりませんからね。 とりあえずはN末端とC末端につけたコンストラクトを両方作ってみて どちらがendoの分子の局在や活性などに近いかcheckすべきです。 またスペーサーを入れることで影響を最小限にしたりすることができることもあります。この場合のスペーサーで多く使われるのは (Gly-Gly-Gly-Ser) or (Gly-Gly-Ser)をタンデムに4,5個ぐらいつなげたものか (Ala)を20個ぐらい並べたものでやるのが多いです。 ただこれらをやってももうどうしようもないものもやっぱりあるのでそういう時はGFPなどはあきらめてFlashや最近だとHalo-tagなど小型の低分子によるラベリングタグなどにシフトするしかないです。 詳細は下記のpaperを参考にしてください。 Zhang, J., Campbell, R.E., Ting, A. and Tsien, R.Y. 2002. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nature Review Molecular Biology 3:

GFP融合タンパク質 削除/引用 No.71-1 - 2007/08/16 (木) 17:51:27 - パンタ いつもお世話になっています。 直接実験のことではないのですが、GFPをつけた時とつけないときで、挙動が変わってしまった報告、あるいは経験などはあるでしょうか？　GFPが影響を与えにくいとは言っても、ある機能がマスクされてしまったりしないのでしょうか？　特にGFPよりも小さなタンパク質を見るときは、より大きな影響が出てしまう気がするのですが。 また、逆にGFPが影響を与えないようにするための工夫（例えば目的タンパク質とGFPの間にスペーサー配列を入れるなど）はあるのでしょうか？ 幅の広い質問になってしまいましたが、よろしくお願いします。

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