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(無題) 削除/引用 No.708-5 - 2008/02/21 (木) 16:45:18 - aaa たびたび、ありがとうござます。 確かに、浸透化溶液:クエン酸ナトリウム0.1%中0.1 % Triton X - 100で8分処理とマニュアルのほうにありました。 アドバイスにありますように、HNPPがにじみやすいということを考えると、 “TUNEL（クエン酸バッファー＋Triton Xによる処理）→AP活性染色” で一度トライしてみようと思います。 丁寧に回答していただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.708-4 - 2008/02/20 (水) 21:00:12 - AP その方法やプロテアーゼ処理のほかに、浸透化溶液:クエン酸ナトリウム0.1%中0.1 % Triton X - 100で8分処理（温度が書いていないので室温か？）というのもあがっていますが、それでは無理なんでしょうか。 HNPPがにじみやすいことに配慮して、先にTUNELをやるとすると過度の加熱や、プロテアーゼ処理はいずれにしてもAlk Phosを失活させる可能性が否定できませんね。一方、内在性のAlk Phosは結構失活しにくい、たとえばパラフィン包埋で有機溶媒をくぐったり60度くらいに加熱されても活性染色できるそうなので（だからパラフィンでやるのですよね）、浸透処理のときに加減を見て熱を加えるのは可能かもしれません。内在性Alk phosの活性染色でカウンターステインした経験がないのでいい加減なこといっているかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.708-3 - 2008/02/20 (水) 19:42:15 - aaa 情報不足ですみません。回答ありがとうございます。 切片なのですが、パラフィン切片で行おうと考えています。 なので、クエン酸バッファー＋電子レンジによる処理を考えていたのですが…。

(無題) 削除/引用 No.708-2 - 2008/02/20 (水) 18:23:10 - AP >できればTUNEL時に行う抗原賦活化（クエン酸バッファーによる加熱処理） この場合は、固定標本上でTdT酵素反応をするのに、反応液が染みこみやすいようにするということではないですか。マニュアルでは、クエン酸バッファー、氷温あるいは室温で数分の処理になっていませんか？　むしろTriton-X100を加えているのがミソだと思います。 パラフィンセクションの場合のみ、選択肢の一つとして電子レンジで処理するという方法があげられていますが、積極的に加熱処理を奨めているわけではないですね。 露出していないエピトープを曝露するための抗原賦活化処理ならクエン酸バッファー＋加熱でしょうが、それとは明らかに違いますね。 抗原賦活処理は免疫染色ならどんな場合にでも必要というわけでもなく、そうしなければうまくいかないときだけです。一般的に核DNAに対する抗体染色はそういう処理は必要ないか、DNAを断片化して賦活化するのであって、クエン酸バッファーによる加熱処理で抗原抗体反応性が良くなるとは考えにくいですし。 内在性アルフォスの活性染色を考えておられるので凍結切片で、TUNELはフロレセイン標識の抗体で蛍光検出する、と想像して手順を考えると、 HNPP/TRは沈着性がそれほど高くないので（有機溶媒には容易に溶ける、水系でも長時間だとにじんできやすい）、この発色の後、TdT反応、抗体反応、洗浄などをするのはさけた方がよさそうです。 凍結切片なら、マニュアルに従えば、氷温2分のクエン酸バッファー処理でよく、TdT反応、抗体反応のあと、アルフォスの活性染色でいいのではないでしょうか。

HNPP/TRとTUNEL（フルオレセイン） 削除/引用 No.708-1 - 2008/02/20 (水) 12:44:39 - aaa マウス胚の切片を用いて、内在性のアルカリフォスファターゼのdetect（HNPP/TR）を行った後にTUNEL（Roche キット）を同時に行い、merge した像をとりたいと思っています。 アルカリフォスファターゼは熱に弱いため、できればTUNEL時に行う抗原賦活化（クエン酸バッファーによる加熱処理）前にdetectしたいと考えているのですが、加熱によってHNPP/TRに影響がえるのではと考えています（HNP/TRが除去される、蛍光がよわくなるなど…）。 ProKなどによる賦活化のほうがよいのでしょうか。 なにかアドバイスいただけるとうれしいです。よろしくお願いします。

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