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追伸 削除/引用 No.705-14 - 2008/03/03 (月) 11:01:22 - くりくりん 誤解を招く書き方をしてしまったので訂正します。 オリゴのデザインはmutationを入れたい場所の3'側のTmを60℃、 5'側のTmを30℃になるようforward,reverse共に設計しています。 設計方法に関しては私の工夫ではないので分かりません・・・ ＞また、この場合は変異箇所が必ずしもオリゴの真ん中になっていないということですね？僕は今までほとんど真ん中に設計してきましたが、必ずしもそれは必要ではないのでしょうか？ この方法でうまくいっているということは、恐らく真ん中に設計する必要は ないということだと思われます。

(無題) 削除/引用 No.705-13 - 2008/02/27 (水) 19:44:05 - aaaaa Tさんフォロいただき、ありがとうございます。 私はメガプライマー法を使ったことがないので わかりません。今年に入って樋口法で２０個程度 変異体を作っていますが、すべて一発で できました。 変異プライマーは、変異箇所を中心に全長20-25bp程度、 全長増幅用プライマーも変異プライマーもTmは気にしません。 ベクターからせいぜい数ｋｂｐのフラグメントを増幅するだけですので、 ２５サイクルもPCRをまわせば大抵増幅されますよ。 心配ならば１０％くらいDMSOを隠し味に入れておけば GCリッチでも大抵まわります。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.705-12 - 2008/02/27 (水) 19:01:43 - Ｔ > 樋口法・・・はじめて聞きました。興味深いですね。悲しいことに当研究室にはモレクロがないのですが、知人に見せてもらおうと思います。 原報は Higuchi R, Krummel B, Saiki RK. Nucleic Acids Res 1988; 16: 7351-7367 です。 私は mutagenic primer が１本で済む通常のメガプライマー法を常用していますが、樋口法の方が失敗は少ないだろうと思います（試したことはありません）。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.705-11 - 2008/02/27 (水) 18:34:52 - むすくる pemさま そうですか、12 cycleでもバンドは見えるのですね。今まで見えないものと考えていました。これからはチェックしてみるようにします。 aaaaaさま 樋口法・・・はじめて聞きました。興味深いですね。悲しいことに当研究室にはモレクロがないのですが、知人に見せてもらおうと思います。 くりくりんさま 具体的な方法を教えて下さって大変参考になります。ありがとうございます。やはりバンドをチェックされているのですね。勉強になります。オリゴのデザインはなかなかこだわりの工夫のように感じます。教えていただけて嬉しいです。これはどういう意図の工夫なのでしょう？(3'側がloose?) もしよろしければコメント下さい。 また、この場合は変異箇所が必ずしもオリゴの真ん中になっていないということですね？僕は今までほとんど真ん中に設計してきましたが、必ずしもそれは必要ではないのでしょうか？ 現状報告ですが、プライマーを少し長めに設計して(33base)、Pfuとは違うpolymeraseも含めて再度PCRしています。今度は電気泳動で確認してみたいと思います。

私の場合 削除/引用 No.705-10 - 2008/02/25 (月) 13:59:56 - くりくりん ご参考までに私の行っている方法をお知らせします。 今までこの方法でうまくいかなかったことはほとんどないです。 templateは8,4,2,1ngの4種類、使用しているのはnative Pfu、 PCR conditionはtemplateにかかわらず 94℃　4min 20cycles of 95℃　30sec 59℃　30sec 68℃　19min 25ulの系のうち5ulを泳動しバンドが確認できた 一番templateの少ないsampleを用いてDpnI処理2hrを行います。 これを1 or 2ul、transformします。 オリゴのデザインはmutationを入れたい場所の前のTmを60℃、 後ろのTmを30℃になるようforward,reverse共に設計しています。

(無題) 削除/引用 No.705-9 - 2008/02/25 (月) 10:43:09 - aaaaa メガプライマー法の変法の樋口法なんかは、 気を使わず、検討もほとんどいらず、さくっと 変異体をとれますよ。モレクロにのっています。

(無題) 削除/引用 No.705-8 - 2008/02/24 (日) 17:56:52 - HG このQuickChangeのプロトコールに関連して質問させてください。 このようにプラスミドを一周するようなPCRを用いたtrickはいろいろありますが、その場合にプラスミドはclosed circlarの二重鎖のままで鋳型となっているのでしょうか。これだと、親プラスミドの２本鎖のそれぞれに着目すると、全長が複製されたときには完全にほどけた形になるので、トポロジカルに無理があるように思えます。 それともわずかに含まれる、ニックによって変性条件では一本鎖になった分子が鋳型となっているのでしょうか。 後者であれば、親プラスミドにニックを導入するような操作をすれば、反応の効率が上がるでしょうか。 古いフォーラムで同様の質問をしたときにはコメントをいただけなかったので、再掲させていただきました。

サイクル数 削除/引用 No.705-7 - 2008/02/21 (木) 12:06:01 - pem 反応サイクルは、だいたいは12サイクルです。 また、反応スケールを50マイクロリットルで行なっていますので、 そのうち5から10マイクロリットルを泳動し、 バンドが確認できたら、残りを形質転換に使っています。 12サイクルでも、バンドは確認できますよ。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.705-6 - 2008/02/20 (水) 11:48:06 - むすくる pemさま　ありがとうございます。 僕も最初はtemplate量を1ng,5ng,10ngとふっていたのですが、 それでコロニーが0だったので、Stratageneのマニュアルのトラブルシューティングにしたがって100ngまでは増やしてみたという経緯です。 あべちゃんさま、pemさま、お２人の意見を合わせると、PCRがかかっているかが重要で、それは電気泳動で確認できる、ということですね。 ただ、12cycle程度のPCR(厳密にはPCRと呼べないですが）でバンドが見えるのでしょうか？pemさまがバンドを確認している時は何 cycleくらいまわされてますか？またそれはあくまでバンド確認用なんでしょうか？それとも同じcycle回したものの一部を確認泳動、一部を形質転換に使う感じなのでしょうか？お返事いただけると幸いです。

電気泳動で確認 削除/引用 No.705-4 - 2008/02/20 (水) 10:58:27 - pem 増幅反応後に電気泳動してみると良いです。 うまく行っている場合は、増幅できたバンドがはっきりと確認できます。 私の経験では、ここではっきりと確認できなかった場合は、 この先進めてもほとんどうまくいかないです。 反応液にtemplateを10 ngにした場合、 5μｌ電気泳動してもエチブロ染色でtemplate由来のバンドは ほとんど見えません。 形質転換後に元の配列のものが取れるのは、templateが多いためでしょう。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.705-3 - 2008/02/20 (水) 10:42:12 - むすくる あべちゃんさま ありがとうございます。そうですね、PCRがかかってないのが疑われますよね。 Pyrobestはうちのラボでも持っていますので試してみようと思います。 プライマーがダイマーをつくるとか、アニーリングしにくい配列なのか、 なども心配してしまうのですが、site-directed mutagenesisの時は変異を 中心にしたプライマー設計になるので、クローニングの時ほど配列を変えられ ないのかな、と思ってしまいます。

酵素とサイクル 削除/引用 No.705-2 - 2008/02/19 (火) 21:12:08 - あべちゃん 根本的な解決ではないのですが、以前、私もストラタジーンの例のキットで、目的のものが取れなかったときに他のハイフィデリティーポリメラーゼを使いました。 目的のものが取れないのはPCRがうまくいっていないからでは？と考えたからです。 あと、サイクル数は普通に２５くらいまで増やしたりしています。 具体的にはTakara PyrobestあるいはRoche Hi-Fidelity Taqとかです。 テンプレートを増やすと、元のプラスミド由来の形質転換体が現れやすくなるんじゃあないでしょうか？ 重複しますが、目的のプラスミドが取れない＝PCRがうまくいっていない と考えて、僕は対応しています。

site-directed mutagenesisがうまくいきません 削除/引用 No.705-1 - 2008/02/19 (火) 19:55:08 - むすくる 先日はタンパク質発現・精製の話題でお世話になりました。 今日はsite-directed mutagenesisについて質問させて下さい。 Stratageneの原理でplasmidを反対方向に１周回す方法でmutagenesisを行っています。たいていの場合は成功するのですが、時々どうしてもうまくいかない場合があります。こうなった場合、どのような点を改善するように努めるべきなのでしょうか？みなさんのお知恵をお借りしたく思います。 現在、手こずっているmutagenesisは、まずコロニー数が15個程度と少ないです。 DNAが増幅される方向に改善しようと、templateを100ngまで増やし、anealing温度を低めの50℃、55℃で試し、extension timeも2min/kbにしています。PCR cycleは12 cycleしか試していません。 primerは変異を中央にした27bpのもので、両端がgc,ccとなっています。GC content 74%, primer Xというサイトで計算したTmは82.8℃です（SIGMAのサイトで計算すると71.7℃ですが）。生えてきた全コロニーを拾ってみましたが、すべてWT、つまり親のtemplate DNAでした。DpnI処理は2時間しています。 以前のトピックも読みましたが、今一度、この原理のsite-directed mutagenesisがうまくいかない場合の対処法として、皆様の工夫を教えていただけないでしょうか。宜しくお願いします。

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