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(無題) 削除/引用 No.699-9 - 2008/02/21 (木) 14:49:15 - POM ありがとうございます。意見を聞かせていただいている限り、妥当な数字を出せていたと思います。あとは、なるべくもとのRNAの収量をふやすべく努力します。

(無題) 削除/引用 No.699-8 - 2008/02/21 (木) 12:05:10 - やまさき ご存知と思いますがtotal RNAのうちmRNAは3%です。oligo dtだとcDNA合成効率が30％あったとしても1まいくろグラムtotal RNAから一本鎖cDNAは10ng程度しか合成できません。ですのでおっしゃっている濃度は妥当な数値ではないかと推察します（濃度のみでトータル量が示されていないのでなんともいえませんが）。 一般的に1マイクログラムのtotal RNAから合成したcDNAで20回分のRT-PCRに使用できると昔のボスに教わりました。これは非常に大まかな話で、発現量の多い遺伝子を見る場合はもっと希釈できますし、逆なら濃縮する必要があるかも知れません。ですが大まかな目安としては1マイクログラムのtotal RNAから20マイクロリットルの系でcDNA合成して、10ないし20マイクロリットルのPCRに鋳型として1マイクロ加えればよいということになります。 cDNA合成したあとは精製したほうが良いのかも知れませんが、あまり精製する話は聞いたことがないのでそのままPCRに持ち込んでも良いのではと思いました。

(無題) 削除/引用 No.699-7 - 2008/02/19 (火) 19:59:22 - 生食 私もカラムは通してますがRNA抽出後にDNase処理後に、DNaseの除去と精製を兼ねて通してます。これで大分純度が上がるような印象です。 その後RNA量をそろえてRTすることで大分精度がよくなったと思っていますが

(無題) 削除/引用 No.699-6 - 2008/02/19 (火) 19:42:14 - RT 例えば　こんな感じでいいと思います。 1ugのtotal RNAを逆転写→そのcDNA溶液（希釈をそろえれば希釈OK）を1ul用いPCR。 おそらく精製をしてしまうと回収率の問題ではなく、定量性に問題が出ると思います。 正確性の問題ですが、逆転写のスタートRNAを合わせば、ハウルキービング遺伝子で補正するのでだいたい大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.699-5 - 2008/02/19 (火) 18:57:37 - POM すいません。tRNAはtotal RNAのつもりで書いてしまいました。誤解を生んでしまい恥ずかしい限りです・・・。 皆さんのお話からすると、逆転写したあとはcDNAの濃度を気にせずリアルタイムに移行するということですよね？僕が習っている方法では、RNA量をそろえてRTをしたのち、さらにcDNA量もそろえてリアルタイムを行ったほうがより正確だということだったのですが、あまり影響しないのでしょうか？ それと、QIA QUICKはしなくても良かったりするのでしょうか？僕的にはやったほうがよいと思うのですが、やはり収量は減るのでしょうね。

もしかして 削除/引用 No.699-4 - 2008/02/19 (火) 14:34:37 - 7878 余計なお世話かも知れませんが，tRNAってtotal RNAを意味して使ってらっしゃるのでしょうか・・・。tRNAはふつうtransfer RNAをさすので誤解を生むかと思いますよ。 cDNAの吸光度測定は，dNTPや一本鎖の核酸は吸光係数を高くするので正確な測定はできないかと思います。QIA quickでどこまで精製できるのか私にはわかりませんが，結局リアルタイムPCRで発現量を定量するなら，労力の割には得るものが少ないcDNA合成後の吸光度測定はしないのが一般的だと私は思います。

(無題) 削除/引用 No.699-3 - 2008/02/19 (火) 13:41:07 - あーる RTしたｃDNA量を測定すること自体がナンセンスだと思います。 RTが上手くいっているかどうかの確認はGAPDHなどのプライマーでPCRを行うのがベストだと思います。

(無題) 削除/引用 No.699-2 - 2008/02/19 (火) 12:57:07 - とも tRNAをoligo dTにかけたのですか？？ あと少量サンプルのときはサンプルがチューブにくっつくことがあるので、核酸がくっつきにくいlow binding　チューブっていうのが売っていますのでそれを使うことをお薦めします。 mRNAはtotal RNAの数%しかないのでものすごく少ないですよ。 あまりcDNAの量を気にしなくてもいいと思いますよ。

微量のRNAからのｃDNA合成 削除/引用 No.699-1 - 2008/02/19 (火) 11:54:36 - POM こんにちは。先日脊髄からのmRNA抽出について相談させていただいた素人のものです。とりあえず、脊髄からは少量のRNAしか抽出できないということで、1ugのtRNAからcDNAをつくり、RealTime-PCRに移行しようと思い、エタチン→Oligo dT Mix→DTT Mixで常法通りcDNA合成をし、Qia quickにて精製後、吸光度を測定したのですが、A1/A2：1.3前後、A1/A3：1.3前後と芳しくなく、ピークもはっきり見えません。結局、濃度も3〜5μg/mlで、期待していた以上に少ない気がします。以前脊髄からとったtRNA10μｇから同様の手順で行ったときはcDNAは80μg/ml取れたので、cDNA量はそんなものなのかもしれませんが、吸光度がよろしくないので、失敗のような気がします。（PCRで確認すればよいのでしょうが）。１μgという少量のtRNAからcDNAを作る際、標準的にどれぐらいのcDNAが合成できるのでしょうか。また、吸光度等はやはり気にしたほうがよいのでしょうか。よろしくお願いします。

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