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ありがとうございました！ 削除/引用 No.696-5 - 2008/02/21 (木) 13:02:42 - 悩んでます… とても参考になりました！ ありがとうございました。

perforation 削除/引用 No.696-4 - 2008/02/20 (水) 19:10:45 - sea 気になることがいくつかあるので順に書いて見ます。 下記の項目についてチェックしてみてください。 (1) 固定法 (2) epitopeの位置 (3) perforation (4) positive control 固定法についてはすでに書かれている方がおられるように、 新しい抗体を試す場合は、培養細胞ではホルマリン系と アルコール系の二種類は試すべきだと思います。 膜タンパクなので、アルコール系でも流れてしまうことはないと思います。 ホルマリン固定でかつ、epitopeが細胞内の場合には、 perforationが必要になると思います。 膜タンパクなので、perforationをしたほうがいい場合としないほうが いい場合とあって、case by caseだと思います。 Tritonなどで試してみるほかにもう少しmildなものも検討しては いかがでしょうか？ それから、そのタンパクが本当に発現しているのかどうか わからないようであれば、抗体の条件検討には、 positive controlになるような細胞を(も)使うべきだと思います。 あとはもちろん、一次抗体二次抗体のaffinityとか蛍光の強さが 保たれているかどうか、も重要でしょう。 そのほかにもたくさんありますが、とりあえずこんなところで。

(無題) 削除/引用 No.696-3 - 2008/02/20 (水) 12:43:03 - Fresh 膜タンパクの免疫染色は、細胞質や核以上に固定法の影響が大きいようです。 条件検討の一つとして、固定法を変えてみるというのもいいと思います。 膜の固定にはPLPが優れているということも聞きますし、場合によってはグルタルアルデヒドを使うことも（抗原性が保たれるなら）、、、、

(無題) 削除/引用 No.696-2 - 2008/02/18 (月) 21:45:00 - 蛍光 蛍光抗体法（IFA）は、一次抗体によって相当蛍光強度が変わってきます。 また、二次抗体に標識されているものによっても蛍光強度および退色が相当変わります。 １．一次抗体を他の人がIFAに用いたデータはあるのか。 ２．二次抗体は何標識のものを用いているのか。 ３．一次抗体、二次抗体は何由来か。 あたりの情報があれば、アドバイスがつきやすいと思います。

蛍光抗体法の発光が弱いです… 削除/引用 No.696-1 - 2008/02/18 (月) 21:10:50 - 悩んでます… いつも参考にさせていただいてます。 培養細胞で蛍光顕微鏡を用いて膜タンパクの発現を見ているのですが、発光がぼんやりとしか見えず、比較検討ができなくて困っています… どなたか原因として考えられることと対処法を教えていただけないでしょうか？ ちなみに、 固定は4%PFAで氷上20分 ブロッキングは10%牛胎児血清加PBSで室温20分 一次抗体、二次抗体ともに37℃1時間 ウォッシュはPBSで3分×3 で行っています。 よろしくお願いします。

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