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(無題) 削除/引用 No.687-11 - 2008/02/21 (木) 00:20:07 - ne あああさん、どうもありがとうございます。 今度は継代数の少ない細胞を使ってみます。

(無題) 削除/引用 No.687-10 - 2008/02/20 (水) 08:39:05 - あああ リポフェクタミン2000の方が、より翌日の細胞の痛みが強いようです。 トランスフェクションの効率はあまり変わらないので、安価なカルシウム法で行なっています。何せin vivoで使用するので、１回に１０センチディッシュ９枚から１２枚ほど使用しているので。。。 それと、継代数ですが、経験的には起こしたての細胞を１回継代してふやしてからすぐに使用したほうが高titerの物が取れています。 うちでは使用するのは、継代して２-３週間くらいの間の物ですね。。。

もう少し質問させてください 削除/引用 No.687-9 - 2008/02/20 (水) 05:37:27 - ne あああさん、どうもありがとうございます。 皆さんにもう少しお聞きしたいのですが、ウィルスを作るときのトランスフェクションはカルシウム法で行った法が良いのでしょうか？うちのラボではトランスフェクションにはInvitrogenのLipofectamin2000を使っていて、私はウィルスを作るときもこれを使いました。 それと、もう一つ、今ラボの人に２９３Tの継代数もトランスフェクションに影響すると言われたんですが、どうなんでしょうか？私は30回くらい植えついだ細胞を使っていますが、GFPで確認した限りトランスフェクションの効率自体は１００％近いようなのですが、継代しすぎると細胞内でのウィルス生産に問題を生じたりするのでしょうか？ なにぶん、細胞培養初心者なもので、基本的な質問ばかりですいませんが、どなたか教えていただけませんでしょうか。

追記 削除/引用 No.687-8 - 2008/02/19 (火) 14:14:47 - あああ 濃縮後で10^7〜10＾9になります。（GFPのみで10＾9くらい）

あああ 削除/引用 No.687-7 - 2008/02/19 (火) 14:13:00 - あ うちでは、トランスフェクションの前日に５×１０^6で２９３Tを培養し、24時間後にメディウム交換をしてから、カルシウム法でトランスフェクション。 翌日の朝、メディウムを交換して、その24時間後に回収しています。 トランスフェクションからメディウム交換までが24時間以上開いてしまうと、細胞が痛んで、剥がれてくる感じです。 回収後は0.22μのフィルターでろ過後、30000rpm(100000g）で2時間遠心して、10センチディッシュ1枚（１０ｍｌ）から５０ulくらいに濃縮します。 メディウムは、最初から最後まで１０%FBS-DMEMを使用しています。 脳内の神経細胞に感染させていますが、titerの測定は、２９３Tで行なっています。１００倍希釈したウィルス液を6wellディッシュ(前日に1×10＾5）に５０ul、１０ul、2ulと感染させて見ています。

(無題) 削除/引用 No.687-6 - 2008/02/17 (日) 11:21:54 - ne ともさん、 色々と教えていただき、どうもありがとうございます。とりあえず、濃縮を試してみて、それでもだめなようでしたら、教えていただいたように感染効率を上げる試薬、あるいは精製を検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.687-5 - 2008/02/16 (土) 13:13:48 - とも 初めて濃縮するときは濃縮前と濃縮後のタイターを測定し、１０倍濃縮したのであれば、濃縮後タイターが１０倍になっていれば問題ありません。 6000gで16時間で濃縮すれば80〜90%くらいの回収率が見込まれます。他の方法ではやったことがないのでわかりません。 精製は細胞によります。上皮系のcell lineは今まで精製必要ありませんでしたが、プライマリーのマクロファージなんかは精製しないと全く感染しませんでした。理由はわかりません。超遠心機がないと精製は困難ですが、最近は超遠心機がなくても精製できるキットがあるらしいので、試してみては。 あとポリブレン以外に感染効率上げる試薬売っていますので試す価値はあると思います。 上記の２つの試薬はともにコスモバイオのViraBindとViraDuctinです。 結構高いですけど。 がんばって

(無題) 削除/引用 No.687-4 - 2008/02/16 (土) 01:43:23 - ne ともさん、~さん、 コメント、参考文献をどうもありがとうございます。 超遠心が身近になかったので濃縮の操作はやっていませんでした。 6000gで濃縮をやってみます。ラボの遠心使用頻度がかなり高いので、時間をもう少し短くしたいのですが、15000gで一晩12時間程度でも大丈夫ですよね。濃縮後の精製は重要なのでしょうか？ ウィルス作製時は293T細胞の80％位でGFPの発現が見られます。使用しているベクターは神経のプロモーターをもっているので２９３Tでの発現は非常に弱いですが。そういうわけで２９３Tでのタイター測定もやっていませんでしたが、濃縮後、神経細胞でタイター測定もやってみたいと思います。 挿入したタンパクのサイズについては考えていませんでした。私のタンパク質は約55kdaですが、同じベクターを使っている文献を調べたところ、80Kdaのタンパク質を発現させているグループもありました。同じベクターでもタンパク質よって発現しやすい、しにくい、というのもあるのでしょうか？大腸菌のタンパク発現の時みたいにベクターを変えてみたりとかするものなのでしょうか？ ポリブレンは神経細胞ではToxicらしく加えていません。何か他に代わるものがあれば良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.687-3 - 2008/02/15 (金) 16:10:04 - ~ 293Tでのタイターを測っておくと、 ウイルス自体の出来が悪いのか、ウイルスと細胞の組み合わせの問題なのかが切り分けられると思います。 それと、その細胞を触ったことが無いのですが、 使用しているウイルスベクターはその細胞での実績があるものでしょうか？ 感染性やプロモーター活性に問題が無いことが分かっているのでしたら、 ウイルスの出来か、感染方法のどちらかに問題があるような気がします。 >GFP-fusionタンパク質を... 挿入している配列が長いために、パッケージングの効率が落ちているのかも知れません。ベクターに推奨が何kb以下という表記はありませんか？ GFPのみで発現が低いのであれば、感染数が少ないか、プロモーター活性がその細胞では低いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.687-2 - 2008/02/15 (金) 15:43:09 - とも ウイルスは濃縮していますか？？ 超遠心機があればいいのですが、もしないなら6000gで16時間遠心すれば濃縮できます。最低でも１００倍くらいの濃縮が必要です。 濃縮後精製していますか？？ ウイルス作ったとき293T使っているそうなんですが、ウイルス回収したあと293T細胞にGFPは何%発現していますか？？ 私の場合は100%発現していて、細胞をペレットにすると目で見て緑色に見えます。 また感染させるときにポリブレンなどをいれると効率若干上がります。 最近ではCellにアミロイド繊維が感染にあがると書いてありました。 ペプチドなのでもし興味があるならcell読んでみてください。 VSVのenvで効果があるかどうかはわかりませんが。 最後にnature protocolの2006年Vol.1 p241-5にVermaがレンチウイルスベクターの作製方法書いていますので、参考にしてみては。

lentivirus infection 削除/引用 No.687-1 - 2008/02/15 (金) 09:19:15 - ne 海馬培養細胞である遺伝子のノックダウンをしようとしていますが、lentivirus infectionの効率が非常に低く困っています。以下、長文ですいませんが、哺乳類の細胞自体、使い始めたのが最近なもので、何が問題なのか良く分からず困っています。アドバイスをよろしくお願いします。 使っているベクターはpLentiLox3.7で自分でデザインしたshRNAを発現させるようにしています。2nd generationのパッケージングシステム（pSPAX2, pMD2.G）を使っています。ウィルス生産は７０−８０％confluentの100mm dishの２９３Tで行っており、Co-transfection後6時間でNeurobasal-B27培地に変えて、２日インキュベートして、培地をフィルター後、１ｍLを60mm dishの海馬培養細胞に加えています。infection後４，５日して非常に弱いGFPマーカーの発現が３０％程度の細胞でうっすら見られますが、ノックダウンは確認できませんでした。GFPの蛍光は非常に弱く、自家蛍光を蛍光顕微鏡かでしばらくbleachしないと良く見えないレベルです。 あと、GFP-fusionタンパク質をpFUGWベクターを用いてlentivirusで発現させようとしていますが、こちらは全く、GFP発現が確認できませんでした。pFUGWベクターのみではGFPの発現が確認できましたが、それでも発現レベルが低いようでした。 少し気になったのが、transfection後２日で明らかに培地の色が黄色っぽくなってしまい、細胞も浮かび始めていました。細胞も均等に広がっているのではなく、クラスター上になっていました。こういうものなのでしょうか？ どんなご意見でも結構ですのでよろしくお願いいたします。

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