全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.683-8 - 2008/02/16 (土) 17:03:25 - りょう 多種類の抗体で染める時は、小さな丸型カバーガラス（ポリLリジンなどでコートしたもの）を6cmシャーレくらいに何枚も敷き詰めておき、その上にneuronをまいて培養していました。経時的にカバーガラスを固定することも可能ですし、便利です。小さなカバーガラスだと抗体量も節約できますよ。

(無題) 削除/引用 No.683-7 - 2008/02/15 (金) 16:56:25 - ＰＳ みなさん、ありがとうございます。 個々の胎児についてdisectionからplatingをし、genotypeすればいいのですが、免染で様々な種類を解析しようと思っているので、かなりの数のwellが必要となる予定で。。 また、gently triturationってどれぐらいのスピードなんでしょうか？ 私はfire-polish パスツールで2mlを５secぐらいでストロークしています。

(無題) 削除/引用 No.683-6 - 2008/02/15 (金) 08:49:53 - eco 私もHetのペア由来の胎児から海馬、大脳皮質培養細胞をやってますが、尾だけとっておいて、先にdisectionからplatingまでして、あとからgenotypingしてます。１匹の大脳皮質だけだったら、platingまで1時間もかからないでしょうから、その方が確実なのでは。 それと、1Dさんのように、私もB27 mediaを使ってます。あと、disectionまでは私もPBSではなくHBSSを使っています。多分、胎児のままPBSにつけているようなので特に問題ないとは思いますが、disectionの時はHBSSの方が良い気がします、、、比べたことはありませんが。トリプシンはPBSの方が良く効くとラボのテクニシャンに言われたので、私はそこだけPBSにしてます。HBSSでも問題ありませんが。

(無題) 削除/引用 No.683-5 - 2008/02/15 (金) 00:39:52 - りょう Genotypeしてから培養しないと駄目なのでしょうか？ 全胎児から個別にneuronを培養しておき、その後、採取しておいた尾でGenotypeをし、必要なシャーレだけ実験に使用する。 WT, HT由来のneuronと比較してKOで起こっている現象を語るのでは？

(無題) 削除/引用 No.683-4 - 2008/02/15 (金) 00:24:31 - 1D PSさん、 基本的には私の手技とほぼ同じです。 試薬で異なる点では、 digestion; PAPAIN 15min. 37°C Culture medium; 2% B27/Neurobasal, を用いています。 また、大脳皮質を取り出した後はすぐcold-HBSSに組織を移し、digestionまで氷上保存しています。 実験系の都合上私もPLLコートしか行っていませんが、10,000 cell/cm2であれば主観では12時間後には3-4割くらいが教科書どうりのstage3の形態を示しています。 48時間後ではほぼすべてのneuronがprocessを出しています。 予備実験と結果が違うのであれば、wild typeのサンプル調整時も氷上で冷却するステップを追加するか、genotypingの結果wild typeが得られたら、同時に調整して実験に使用する方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.683-3 - 2008/02/14 (木) 16:04:18 - ＰＳ 1Dさん、ご返事ありがとうございます。 氷上での放置は大丈夫そうですね。私は、 胎児を取り出し、cold-PBS保存 tail-cut、genotyping (2-3h) forebrain digestion (0.25％trypsin/PBS) 10min 37℃ + medium (Neurobasal medium+10%FCS, 2mM Glutamine, B27) +DNaseI trituration 10times filtration 0.4um cfg resuspend in medium (Neurobasal medium+ 2mM Glutamine, B27) cell count plating 10,000cells/cm2 (dish: poly-L-lysine coated) culture 以上で行っています。 予備実験に比べ上記の方法で行うと、neuriteが24h培養後でも伸びていない（細胞は生きているようです）というところで、うまく行っていないと判断していました。 どうしても、解析の都合上、個々の細胞を観察したいので細胞数を低くしたいのですが、生存率が極端に悪くなるという印象もあって、なかなか系が立ち上がりません。。

(無題) 削除/引用 No.683-2 - 2008/02/14 (木) 13:47:17 - 1D PSさん、 私も常時遺伝子改変マウスを用いてprimary neuronを調整しています。 私の所属するラボでは、胎児のtail-cutからgenotypingが終了するまで大体6時間くらいかかっています。 結果が判明するまでの間は、cold-HBSSに胎児を入れて氷冷しています。 genotyping終了後、大脳皮質、海馬のprimary neuronを調整していますが、特段問題も無く行えております。 私の経験では、9時間まで氷上で保存しておいても大丈夫でしたので、氷上での放置がそれほど問題になっているとは考えにくいです。 PSさんの調整方法がどのようなものか書かれておられないので、その辺を書いてくださると、もう少し具体的なアドバイスも出来ると思います。

大脳皮質神経細胞の初代培養 削除/引用 No.683-1 - 2008/02/14 (木) 12:35:22 - ＰＳ いつも参考にさせていただいております。 ある遺伝子改変マウスを用いて、大脳皮質神経細胞の初代培養を行おうと思っています。マウスはホモでの維持が出来ないために、ヘテロでの交配になってしまい、胎児のgenotypeをしなくてはいけません。そこで、胎児を氷冷PBSなどにいれておき、genotype後（２−３時間放置）培養を開始していましたが、なかなかうまく培養できていません。野生型を使った予備実験（氷冷PBS 放置無し）ではうまく培養できています。そこで、Genotype中の放置が原因かもしれないのですが、どのくらいの時間の放置は大丈夫なのでしょうか？また、このようなgenotypeを必要とする初代培養を行っている方がおられれば、どのようにやっているか教えていただければ幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---