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(無題) 削除/引用 No.67-11 - 2007/08/30 (木) 18:57:56 - ats ふなむしsan 培地に関しては、transfection後の交換培地です。lipofectionでもCaCl2法でも、DNA/transfection試薬をいれた培地を翌日交換し、2日ほどvirus産生させます。そのときの培地です。栄養が豊富な方が良いようです。Forskolinは、理研のHPからDLできる三好先生のprotocolに載っています。細胞内のcAMP濃度を上げる作用があり、(その先の理由は知らないのですが）virus産生が増えるそうです。

titerをあげる 削除/引用 No.67-10 - 2007/08/30 (木) 17:01:29 - ふなむし やはり、皆さんいろいろと工夫されているのですね。 まだ、はじめていないのですが、皆さんのご意見を参考にやってみたいと思います。 atsさま 　勉強不足で良く分からないのですが、 「DMEM+10% FCSではなく、advanceDMEM+2%FBS+HT(Hypoxanthine,Thimidine:核酸の材料)+10uM Forskolin+Penicillin+Streptomycinでvirusを調製しています。」とありますが、これはどのような方法なのでしょうか？？ 　トランスフェクションする際のメディウムを上記のものに変えるということなのでしょうか？？？

(無題) 削除/引用 No.67-9 - 2007/08/30 (木) 15:34:45 - 事故調 感染事故があったとしてもそれと分かることはないでしょう。自分の表皮を剥がしてウエスタンでもしない限り。

感染事故 削除/引用 No.67-8 - 2007/08/30 (木) 14:32:40 - ついで 皆さんについでに御聞きしたいんですが、レンチベクターだとヒトにも感染しますよね。 感染事故が怖いんですが、身近で事例がありましたでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.67-7 - 2007/08/29 (水) 15:50:24 - SQ/TQ じぶんも個々に 取り直してやってました。 　確か3種類のプラスミドが入っていたはずですが、 それを大腸菌に入れなおして、 コロニーをたくさんつついて、 3種のプラスミドを持ったクローンをそれぞれ選択してきました。 細胞にTransfectionするDNA量は 1:1:1:1(レンチベクター:pLP1:pLP2:pVSVG)でやっていましたが、 普通にうまくいきました。 混合比を変える検討はやっていないので、 変えてタイターがあがった方、ぜひ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.67-6 - 2007/08/29 (水) 14:03:02 - ats 私は、もとのmixかなり薄めて大腸菌に導入し、個々のcolonyがどのplasmidを持っているかcheckしました。plamidは、endotoxin-free gradeのkitを使っています。 混合比は、もとのmixを泳動して同様の染色比になるように混ぜました。 確か、wt/wtで1:1だったような？ rotごとに至適化すべきなのでしょうが、取りあえずvirusは取れます。 また、DMEM+10% FCSではなく、advanceDMEM+2%FBS+HT(Hypoxanthine,Thimidine:核酸の材料)+10uM Forskolin+Penicillin+Streptomycinでvirusを調製しています。 titerはやや高くなるようです。

ありがとうございます 削除/引用 No.67-5 - 2007/08/21 (火) 08:46:30 - ふなむし Ｔ様 なるほど。。。。 そういう風に考えれば良かったのですね。 検討して、やってみようかと思います。 出来上がるまでに時間はかかりそうですが、なにしろ極貧なもので・・・・。

(無題) 削除/引用 No.67-4 - 2007/08/15 (水) 18:24:33 - Ｔ それでもいいと思います。 私の場合は、適当な制限酵素で切って１種類のプラスミドだけが切れずに残るような状況を作り、ゲルに流して ccc のバンドを抜き出してトランスフォーメーションに使いましたが。

T様 削除/引用 No.67-3 - 2007/08/15 (水) 17:39:43 - ふなむし T様 　やはりできるのですね！！ 　その際、シークエンスから共通の制限酵素のユニークサイトを探して、DNAをリニアライズしてからジェルでそれぞれ回収し、再度環状にしてから増やした方が良いのでしょうね。 　でも混合比を決めるのが、結構手間がかかりそうですね。

(無題) 削除/引用 No.67-2 - 2007/08/15 (水) 16:36:22 - Ｔ 可能です。別に問題なく使えます。 混合比は最適化する必要がありますが。

ViraPower 削除/引用 No.67-1 - 2007/08/15 (水) 16:24:53 - ふなむし ちょっと思ったのですが、インビトロジェンのレンチウィルスキットのViraPowerをお使いの方にお聞きしたいことがあるのですが、キットの中に入っている　ViraPower™ Packaging Mix　は、リトラして増やして作ることは可能なのでしょうか？？？ やってみた方、いらっしゃいますか？？？

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