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(無題) 削除/引用 No.668-7 - 2008/02/15 (金) 13:32:32 - mi かわ様、 貴重なご意見をありがとうございます。 核内抗原がなかなかうまく染まらず困ったことがありましたので 次回そのような染色をするときには試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.668-6 - 2008/02/14 (木) 18:34:34 - かわ 凍結切片でも界面活性剤や両親媒性溶媒による処理をしたほうが明らかに抗体反応性があがる場合があります。特に核内抗原などはその傾向が強いと思われます。また最近は共焦点顕微鏡で観察するため少し厚めの切片を作成する場合がありますが、その場合でもこういう処理は効くことがあります。タンパクによるのでまずは試してみることですが。

(無題) 削除/引用 No.668-5 - 2008/02/14 (木) 09:36:27 - mi 仕事中さま、 ご意見ありがとうございます。 培養細胞のFACS固定と凍結切片では少し異なるかもしれませんが、 メタノールは細胞膜の破壊と同時に固定のような働きもあるという ことですね。

(無題) 削除/引用 No.668-4 - 2008/02/13 (水) 19:38:45 - 仕事中 培養細胞をPFAで固定してFACSするときにメタノール処理しているのを聞いたことがあります。 「水分を飛ばす」というようなことを言っていましたが、PFAだけでは固定が不十分な構造をメタノールで固定しているのではないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.668-3 - 2008/02/13 (水) 12:08:37 - mi キヨッチ様、 バックグラウンドの原因や抗体の浸透の原理の説明までしていただき ありがとうございました。よく理解できました。 今後はしっかりアセトンを飛ばしてから次に進みたいと思います。 ２、についてですが、凍結切片の細胞質の場合は必要ない、との ことでしたが、特殊な場合（核内タンパクを染めるときなど）には メタノール処理が有効な場合もあるのでしょうか？ 引き続き、ご存知の方がおられましたら教えていただけると助かります。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.668-2 - 2008/02/12 (火) 20:21:01 - キヨッチ 自分も培養細胞について免疫染色を行っていますが、 １、についてですが、アセトンが組織内に残っている方が問題だと思いますので、 ドライヤー等で冷風を当て、完全にアセトンを飛ばしたほうが良いと思います。 乾燥させるとバックグラウンドが上がる、というのは・・・ 抗体等を作用させてる時に、乾燥させることで組織内に抗体が タマゴの白身のように固まってしまうということが原因だと思います。 そのため、この場合は完全にアセトンは飛ばしてしまったほうが良いかと・・・・・ ２、培養細胞などではPFAで固定した場合細胞膜が残っており、抗体が浸透しずらいです。そのため、細胞膜を有機溶媒や界面活性剤によって破壊することで、浸透しやすくするのです。 しかしながら凍結組織切片では氷晶が膜を破壊している上に切断により細胞質が露出してると思いますので、通常は必要無いです。

免疫組織染色でのアセトン固定とメタノール処理について 削除/引用 No.668-1 - 2008/02/12 (火) 18:43:01 - mi 凍結切片の免疫組織染色（蛍光抗体法）を行なっています。 ２点お聞きしたいことがあります。 １、些細な質問で申し訳ないのですが、最初の固定の行程で アセトン固定をした後は、切片はよく乾かすべきなのでしょうか？ それとも、乾かさずにそのままPBSで洗浄してしまって良いのでしょうか？ 「バックグラウンドが高くなるので切片は乾かさないように」と教えられてきたのですが 抗体のデータシートやプロトコルを見ても記載されておらず どちらが正解なのかわからず困っています。 ２、羊土社のプロトコル本「免疫染色、in situハイブリダイゼーション」の 蛍光抗体法のところで、 「4%PFAで固定後、-20℃メタノール30minで処理して抗体の浸透性を高める」と いう記載がありました。 私のラボでは今までそのようなプロトコルを試したことがないのですが、 免染をルーティンでされている方は一般的にメタノール処理をされているのですか？ どのような場合にこの処理が有効なのか、経験をお持ちの方がいらっしゃいましたら 教えていただけないでしょうか？ また、このときもメタノール処理後は切片を乾燥させてから次の行程に進むのですか？ ご存知の方がおられましたら教えていただけると助かります。よろしくお願いします。

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