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PCR産物回収 トピック削除
No.663-TOPIC - 2008/02/12 (火) 10:05:33 - KAC
ノーザンをすることになりProbeを作成するため、
TotalRNA 0.5ugからcDNAを作成し(50ulx3、GE RT-PCR kit)、そのcDNAをテンプレートに目的の配列を増幅させました。
それを精製するためにQIAGENのPurification Kitを使用し、約20ng/ul回収しました。
得られたpurity(260/280)が2.0となって得られたDNAがpureではない気がしてなりません。
ちなみにDNAのElutionはEBを用いました。

TotalRNAから目的のPCR産物をどれくらい得られるか予想できるのでしょうか？また、この得られたDNAのPurityはどうなのでしょうか？

この分野をかじったことがないので、教えていただけると幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.663-11 - 2008/02/18 (月) 15:40:18 - かわ
たしかにそれはそうですね。バックの低いプローブ作成にはクローニングが必要ですね。

(無題) 削除/引用
No.663-10 - 2008/02/17 (日) 11:41:54 - ats
>[Re:9] かわさんは書きました :
> ゲルから抽出して確認はダイレクトシーケンスでよいのではないでしょうか？

1/20量の混入だと見逃しますよ。

(無題) 削除/引用
No.663-9 - 2008/02/16 (土) 17:04:23 - かわ
ゲルから抽出して確認はダイレクトシーケンスでよいのではないでしょうか？たまたま同じサイズのバンドが重なっていてもシーケンスすればわかるはずですし。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.663-8 - 2008/02/16 (土) 02:57:10 - KAC
ありがとうございます。
とても参考になりました。

(無題) 削除/引用
No.663-5 - 2008/02/15 (金) 12:24:59 - ats
>[Re:4] KACさんは書きました :
> もうひとつなのですが、
> DNA、RNA測定時に
> 260/280を測定するのはRNAとDNAを区別するためですよね？

260/280比が低いと、不純物（タンパク・フェノール等）の混入が疑われます。

> 確かdsかssかTertialで吸光度が異なると聞いたことがあるのですが、
> 確認までに教えてください。

3重鎖では知りませんが、dsでもssでも純度検定の260/280比は変わらないハズです。
OD260を利用した濃度計算の係数が変わります。

> ＞ノ−ザンのプロ−ブにするなら、PCR産物をプラスミドにクロ−ニングし
> ＞塩基配列確認することをお勧めします。その理由は、PCR産物の中に目的
> ＞配列以外のものが混入していると、ノ−ザンブロットでが目的mRNAでない
> ＞ものも検出してしまうからです。
> ゲルから抽出してもでしょうか？

運？が悪ければ、同サイズの別のものかもしれません...。
特に遺伝子ファミリーや擬遺伝子（転写されているものもある）がある場合は要注意でしょう。

(無題) 削除/引用
No.663-4 - 2008/02/15 (金) 10:37:04 - KAC
もうひとつなのですが、
DNA、RNA測定時に
260/280を測定するのはRNAとDNAを区別するためですよね？
確かdsかssかTertialで吸光度が異なると聞いたことがあるのですが、
確認までに教えてください。

(無題) 削除/引用
No.663-3 - 2008/02/15 (金) 10:35:22 - KAC
初期設定でした。
希釈は行なっていません。20ng/ulでピークが低いので。。。
ちなみにNanoDropで測定しました。

＞ノ−ザンのプロ−ブにするなら、PCR産物をプラスミドにクロ−ニングし
＞塩基配列確認することをお勧めします。その理由は、PCR産物の中に目的
＞配列以外のものが混入していると、ノ−ザンブロットでが目的mRNAでない
＞ものも検出してしまうからです。
ゲルから抽出してもでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.663-2 - 2008/02/12 (火) 11:10:27 - ats
ノ−ザンのプロ−ブにするなら、PCR産物をプラスミドにクロ−ニングし塩基配列確認することをお勧めします。その理由は、PCR産物の中に目的配列以外のものが混入していると、ノ−ザンブロットでが目的mRNAでないものも検出してしまうからです。
クロ−ニングしたものをPCRの鋳型にするのはOKです。
（pBluescript IIのNotI site付近はrRNAに結合しやすい（＝非特異的バンドになりやすい）ので含めない方がよいでしょう）
また、純度に関して、OD260を計るときは、TEに希釈するなどしてpHを7.4-8.0にしても高目でしょうか。
OD320を引き算し（OD260-OD320/OD280-OD320：機器によっては初期設定となっています）が1.8-2.0であれば、純度はOKです。

PCR産物回収 削除/引用
No.663-1 - 2008/02/12 (火) 10:05:33 - KAC
ノーザンをすることになりProbeを作成するため、
TotalRNA 0.5ugからcDNAを作成し(50ulx3、GE RT-PCR kit)、そのcDNAをテンプレートに目的の配列を増幅させました。
それを精製するためにQIAGENのPurification Kitを使用し、約20ng/ul回収しました。
得られたpurity(260/280)が2.0となって得られたDNAがpureではない気がしてなりません。
ちなみにDNAのElutionはEBを用いました。

TotalRNAから目的のPCR産物をどれくらい得られるか予想できるのでしょうか？また、この得られたDNAのPurityはどうなのでしょうか？

この分野をかじったことがないので、教えていただけると幸いです。
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