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(無題) 削除/引用 No.660-5 - 2008/02/11 (月) 23:51:48 - B 私が以前使っていたプロトコールと大きく違うのは、 >7,反応終了後15000rpmにて不溶画分を落としその上清を抽出液としてます。 です。ここで得られた上清はもしかして濁っていませんか？もしそうなら 抽出液中に多量の膜脂質が混入していて何らかの邪魔している可能性が あります。この場合「15000rpmにて不溶画分を落とす」部分を超遠心に かえてください（すいませんが詳しいスピード時間は覚えていません）。 もし超遠心によって膜脂質と抽出液が上手く分離していれば 　上層の透明層：膜脂質 　中層の透明層：目的の膜蛋白質の抽出液 　下層：不溶沈殿 になるはずです。回収は遠心チューブにゆっくとパスツールピペットを 差し込んで中層のみを回収します。

(無題) 削除/引用 No.660-4 - 2008/02/11 (月) 20:43:22 - Ｔ ならば各ステップで取った上清とペレットを全て並べてウェスタンしてみれば、目的の蛋白がどの分画に局在しているか分かり、抽出に問題があるかどうか判明するのでは？ よく使われるプロトコールでは、超音波ではなくダウンス等のホモジナイザーで細胞を潰し、1000G 程度で核を落として除き、上清を１０万Ｇで遠心したペレット（Ｐ２）を粗精製膜画分として使用していると思います。

(無題) 削除/引用 No.660-3 - 2008/02/11 (月) 20:22:25 - ナナ >>Ｔさま いえ、浮かした状態の細胞を免疫染色とwestern blotにて確認したところタンパクが細胞膜に存在しているのを確認しています。

(無題) 削除/引用 No.660-2 - 2008/02/11 (月) 20:01:34 - Ｔ トリプシンで膜蛋白が消化されてしまっただけでは？

細胞膜画分の抽出 削除/引用 No.660-1 - 2008/02/11 (月) 19:30:28 - ナナ 今培養細胞から膜画分に存在しているタンパク質の精製を行っていますが、 現在のプロトコルでは抽出できていないようで、 膜画分がとれていないと考えています。以下のようなプロトコルなんですが、 皆様いかがでしょうか？ 1，培養細胞をトリプシンEDTAで浮かします(10cmシャーレX10枚) 2，3000rpmの遠心で細胞を集めます 3，上清を除き、PBS3mlに細胞を溶かします 4，超音波にて10分氷中で細胞を破砕します 5，10万Gにて超遠心を行いペレット状の物を細胞膜画分とします 6，このペレットに対してRIPA bufferを使用して膜タンパクを抽出します ＊RIPA buffer：S.P.W 910ul + 3M NaCl 50ul + NP-40 10ul + 10%SDS 10ul + 1M HEPES-NaOH(pH 7.4 ) 20ul = 1ml ＊RIPA buffer氷中反応2時間 7,反応終了後15000rpmにて不溶画分を落としその上清を抽出液としてます。 このプロトコルで膜タンパク質は抽出できますでしょうか？ 皆様どうかご教授願います。　　ナナ

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