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T様、~様、本当にありがとうございます。 削除/引用 No.657-14 - 2008/02/16 (土) 00:00:23 - 停止コドン まず、T様ありがとうございます。 現在HA-tagを入れる方向で、プライマーデザインしています。 制限酵素サイトも入れようと思います。ありがとうございます。 次に、~様ありがとうございます。 今、当直中でLA-taq with GC bufferの詳細読む時間がないのですが、 どれぐらいのばせるのかや、どういうpolymeraseのtypeか、 また値段も含め、検討してみます。ありがとうございます。 また実験について、ご指摘のとおり、knock downによる証明も 必要と思います。現時点では、HMG boxがtargetのプロモーターに 結合すること、overexpressionでtargetの遺伝子発現が増加することが、 ボチボチデータが出てきているところですので、 なんとかfull lengthで、きちっとやり、dataが出ると信じて、 次の段階のknock downのdataを出すための準備はし始めたほうが よさそうに思います。ご指摘ありがとうございます。 T様、~様、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.657-13 - 2008/02/15 (金) 19:30:21 - ~ >long PCRのコツなんかあれば、教えていただけませんか？ 私ならば、30mer位のプライマーを作って、LA-taq with GC bufferで試してみます。 マウスならば、ImageClone等で売っているかもしれません。 http://imageclone.com/ 数万円くらいなので、検討する時間や試薬代を考えれば、安いと思います。 また、過剰発現だけではartifactを見ているだけだといわれると思いますので、 shRNAなどでのノックダウンによる解析の準備もしておいた方がいいと思います。 >すみませんが、ICCが何の略か分かりません immunocytochemistry　免疫細胞化学法です。 細胞内の局在などを抗体を使って検出する際に、目的のタンパク質用の抗体が無い場合に、タグ用の抗体で見ることが出来ます。 >PCRがかかり易い、短い配列のHMG boxのみを作って もし応用に近い分野で、truncateであっても治療できればいいというようなテーマであれば、truncateのみで発表できるでしょうけれども、 このまま実験を進めると、 "自然界にあるタンパク質の機能解析" のテーマが目的だったはずなのに、 "自然界に存在しないタンパク質の機能解析" がテーマになってしまいませんか？ 終止コドンがないことによる数アミノ酸の付加やタグの種類などよりも、 こちらの方が大きい問題だと思いますが…

(無題) 削除/引用 No.657-12 - 2008/02/14 (木) 11:51:06 - Ｔ 色々なタグ付きコンストラクトを作る予定があるなら、タグと遺伝子の間に制限酵素サイトを入れておいて、次回以降は切り貼りでタグを付加できるようにした方がいいでしょうね。 幾つか使いやすいサイトを入れた（新ＭＣＳ−Ｃ末タグ）ベクターを最初に作っておくというのも手でしょう。 オリゴは長くなるとそれだけ合成ミスも増えてくるので、PAGE 精製した方がいいですよ。

~様ありがとうございます。 削除/引用 No.657-11 - 2008/02/14 (木) 11:21:19 - 停止コドン ~様ありがとうございます。 ご指摘のとおり、始めの質問は停止コドンについてで、 full lengthとは違う話だったのですが、 ありがたい、ご指摘、アドバイスをいただいているうちに、 tagつきのコンストラクト作成とtagの入れ替えの方へ話が展開しました。 当初の質問のこともありますが、実際のところ、 実験自体は二つの別々のことをやろうとしています。 ひとつは、ご指摘のとおり、CO-IPです。(full lengthと結合する蛋白) もうひとつは、HMG boxの下流での遺伝子発現です。 full lengthはある刺激で、その下流である遺伝子のプロモーターに 結合します。当初、タグ＋full lengthを作って、別々の実験を ひとつのfull lengthで遺伝子発現から、CO-IPまで話を全てすすめる つもりでしたが、insertの遺伝子がうまくPCRがかからず、 full lengthがとってこれなくて、苦肉の策として、 PCRがかかり易い、短い配列のHMG boxのみを作って、 まず刺激なしにプロモーター部分→遺伝子発現をみようとしていました。 またCO-IPもしなければならないので、 B様のご指摘いただいた情報は貴重です。 といったわけで、当初の質問からはずれてますが、 僕にとっては、貴重なご意見ばかりです。 ~様、B様本当にありがとうございます。 今もfull lengthは1380bpぐらいですので、 とってこれないはずはないとおもっている のですが、うまくいってません。 分けてPCRかけたりと、いろいろ試しています。 プライマー設計が悪いのか、Taqが悪いのか、何が悪いのか、 long PCRのコツなんかあれば、教えていただけませんか？ > タグを使ってのICCかco-IPなどを行っていて、 すみませんが、ICCが何の略か分かりません。 ネットや教科書みてたのですが、ひっかかってくれなくて、 よければ、教えてくださいませんか？ > HMGのtruncateの論文はショウジョウバエやHeLa細胞でありました。 ありがとうございます。検索してみます。 いろいろと丁寧にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.657-10 - 2008/02/14 (木) 10:07:59 - ~ ところで、 タグ付きのtruncateを作っているということは、 タグを使ってのICCかco-IPなどを行っていて、 1.タグのみ、2.タグ+truncate、3.タグ+full length で実験して、 1.×、3.○ の時に、２が×、△、○、◎のどれになるかというような実験になるかと思います。 始めの質問を見ると、ご自分ではタグ+ful lengthをやられていないようにも読めますが、 タグ+full lengthがいらない実験なのでしょうか？ それと、参考に出来るかは分かりませんが、 HMGのtruncateの論文はショウジョウバエやHeLa細胞でありました。

B様ありがとうございます。 削除/引用 No.657-9 - 2008/02/14 (木) 00:21:16 - 停止コドン B様、丁寧にアドバイスありがとうございます。 書いていただいたベクターの作り方ですが、 CMVプロモーターとFlag配列の間に制限酵素切断サイト(サイトA,B)を 見つけることが重要ということですね。 ちなみにSal�TとEcl136�Uがありました。しかし、Ecl136�Uはあまり きいたことないし、制限酵素も持ってないので、 このSal�TをサイトAとし、 もとのベクターのMCSの制限酵素切断サイト(サイトCとする)をつかって、 もとのN末のFlagを切り落とそうと思います。 これなら、記載いただいたプライマーで、サイトBをサイトCの 制限酵素切断サイトにして、できたinsert 5'-サイトA-ATG-目的配列-Flag-停止コドン-サイトC-3'を ライゲーションすることで、 5'-サイトA-ATG-目的配列-Flag-停止コドン-サイトC-もとのMCS-3' にすることができそうです。 ありがとうございます。 またTベクターはありますので、一度、こちらに入れてからにしたいと 思います。 しかし、Flagの配列が66bpあるので、プライマーを作成可能かが、 やや心配ですが。HisとかHA,Mycは小さそうなので、できそうです。 いろいろ考えていると、可能性が拡がりそうです。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.657-8 - 2008/02/13 (水) 01:33:21 - B > 今のvectorの配列は > CMVプロモーター-ATG-Flag-MCS-停止コドン　なのですが、 > このうちN末のFlagを切り離し(CMVプロモーターがあり、 > 切りにくいのですが)、制限酵素切断サイトをつけた、 > Flagの配列部分を含むプライマーで短いcDNAをつくり、 > ライゲーションして > CMVプロモーター-ATG-MCS-Flag-停止コドン　にすると > いう意味なのでしょうか？またそれは可能なのでしょうか。 この方法です。例えばC末FLAG-tagを付けたいのであれば、 １．手持ちのベクターのCMVプロモーターの下流にある適当な 制限酵素サイトを見つける（サイトAとする）。 ２．サイトAよりも下流で別の制限酵素サイトを見つける（サイトB とする）。 ３．以下のようなプライマーを設計する。 Forward: 5’-サイトA−ATG−目的遺伝子のN末のDNA配列-3’ Reverse: 5’-目的遺伝子のC末のDNA配列−FLAG-tag−停止コドン−サイトB-3’ ４．インサートは目的遺伝子のテンプレート、2つのプライマーを 使ってPCRし、PCR産物を２つの制限酵素で処理してライゲーション サイトをつくる。 ５．ベクターはインサートの時と同じ2つの制限酵素を使ってライゲーション 　　サイトをつくる。 ６．準備したインサートとベクターをライゲーションする。 もちろんプライマーでつくった停止コドンの後にベクターのATG-MCS-Flag- 停止コドンなどが来るかもしれませんが既に停止コドンのところで転写は 止まってますから気にする必要はありません。もし気になるのであれば サイトＢをベクターの停止コドンより下流で見つけてください。 FLAGのところを6xHisやNHに置き換えればそれぞれのtagが付きます。 N末に付けたければそれに合う様にプライマーを設計すれば良いだけです。 この場合サイトAやBと同じ制限酵素サイトが目的の遺伝子中にあると 目的のクローニングが出来ませんからそこは考える必要があります。 この場合ライゲーションの糊しろが揃っていればライゲーションできる わけですから必ずしもベクターの準備に使う制限酵素のセットとインサート の準備に使う制限酵素セットは同じである必要はありません。例えばSalI と XhoIでつくった制限酵素サイトはライゲーションで繋ぐことが出来ます よね。 あともし研究室にTベクターがあるのならPCR産物はTAクローニングした ほうが確実です。PCR産物をそのまま制限酵素で処理する場合、プライマー の設計によりますがサイトから端までの長さが短いためなどで切れなかったり することがあるからです。この辺りはNEBのカタログである程度確認でき ますが、TAクローニングを省くともし上手くライゲーションできなかった 時に制限酵素処理に問題があったのかラーゲーションに問題があったのか 切り分けられません。TAクローニングしてプラスミドを増やした後に （この時シークエンスの確認もしておくとベターです）制限酵素処理を すれば酵素処理が上手くいっていたかどうかはっきりします。 肝はどの制限酵素サイトを選ぶかとどんなプライマーを設計するかです。 この辺りは掲示板ではアドバイスできませんから同じラボか付近のラボに いるその辺りの経験が豊かな先輩にアドバイスを請うしかないでしょう。 がんばってください。

B様ありがとうございます。 削除/引用 No.657-7 - 2008/02/12 (火) 13:13:14 - 停止コドン B様ありがとうございます。 >FLAGや6xHisのような短いTagならN末tag、C末tagは今使っているベクター >を使っても作り出すことが出来ます。必要な制限酵素サイトを含む >プライマーを設計してPCR、制限酵素処理してライゲーションするだけ >ですから。 N末のFlagをどうやったら、C末に入れ替えれるのか、 いろいろ考えててみたのですが、なかなかidea浮かびません。 根本的に僕の考えていることが間違っているかもしれませんので 下記します。 今のvectorの配列は CMVプロモーター-ATG-Flag-MCS-停止コドン　なのですが、 このうちN末のFlagを切り離し(CMVプロモーターがあり、 切りにくいのですが)、制限酵素切断サイトをつけた、 Flagの配列部分を含むプライマーで短いcDNAをつくり、 ライゲーションして CMVプロモーター-ATG-MCS-Flag-停止コドン　にすると いう意味なのでしょうか？またそれは可能なのでしょうか。 それとも、 CMVプロモーター-ATG-Flag-MCS-Flag(6×His)-停止コドン にするということなのでしょうか？N末とC末にFlagが入るのは、 簡単に作れるイメージがわくのですが、N末のFlagをはずすのは 想像がわきません。僕の考えが間違っているか、方法が何かあるのか、 教えていただけませんか？ また可能なら、Flag-tagをHA-tagや6×His-tagに入れかえるいい方法がないか教えていただけないでしょうか？ 今やっているのは、point mutationを入れる方法で、plasmidを一周させて、 入れ替えようとしているのですが、4717bpのplasmidで、かつ、ある意味 20-30bpのmutationをいれようとしているのですが、うまくいってません。 なにかいい方法がないでしょうか？ >Mouseにこだわらず例えばヒトHMGでN末にFLAGを付けて上手くいっている >論文があればまず大丈夫と判断します。 ヒトHMGの論文ででも、再度検索してみます。 丁寧にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.657-6 - 2008/02/12 (火) 03:59:37 - B >Flagを使ったのはラボにあったということが一番の動機です。 >お金がなくて・・・ただ、調べれる範囲で、mouseHMGだけのリコンビナント >の論文がみつけられなかったということと、ほとんどの論文がfull length >を使っていることと、そのfull lengthのN末端にFlagやHAなどの小さい >Tagをつけたものをみつけたので、いけるかな？と思ってmouseHMGにくっつ >けました。 > また、今でもfull lengthをとってこようと努力しているのですが、 > なかなかうまくPCRがかからず、mouseHMGのみという安易にPCRがかかった > 方に流れてしまいました。 FLAGや6xHisのような短いTagならN末tag、C末tagは今使っているベクター を使っても作り出すことが出来ます。必要な制限酵素サイトを含む プライマーを設計してPCR、制限酵素処理してライゲーションするだけ ですから。周りの先輩にコンストラクションに詳しい人はいませんか？ そういう人に相談出来れば発現させるリコンビナント蛋白質の自由度 がもっと広がるはずです。 もしfull lengthの一番N末端が今発現させようとしているmouseHMGである なら今のままで問題ない可能性は高いと思います。HMGに関してあまり 詳しくないので私の個人的な意見ですがHMGの相同性が高いのであれば Mouseにこだわらず例えばヒトHMGでN末にFLAGを付けて上手くいっている 論文があればまず大丈夫と判断します。FLAGが問題になるとしたら 立体構造的な問題になると思うのですが通常その保存性は 　　　立体構造の相同性　>　配列の相同性 ですから今使おうとしているMouseHMGの配列との相同性が例えば50%以上 ある他種のHMGがN末FLAG付きでリコンビナントとして発現されて、 機能的に問題なければ理論的に考えてまずMouseでも大丈夫です。 > 誰かmouseHMGのリコンビナントについての論文など紹介してもらえないか >と、密かに思っています。 アドバイスはしますが論文に関しては自分で調べる癖を付けられたほうが いいと思います。がんばってください。 > B様のお話のように、Metの有無が実際に関与しているかどうか、 > 検証しないといけないような気がします。 直感的にはそんなに問題ないとは思います。もちろん保障は出来ません から何処まで確認するかは指導教官か指導してもらっている先輩と話し 合ってください。例えば先ほど言ったような他種のHMGの論文が一つでも 見つかればそれで検証は十分と私なら判断します。上手く見つからない 場合は自分なりの意見を持って話し合いにのぞむ必要がありますから 関連論文などの調査にはある程度時間をかけてください。

B様ありがとうございます。 削除/引用 No.657-5 - 2008/02/12 (火) 01:19:27 - 停止コドン B様　返信ありがとうございます。 Flagを使ったのはラボにあったということが一番の動機です。お金がなくて・・・ただ、調べれる範囲で、mouseHMGだけのリコンビナントの論文がみつけられなかったということと、ほとんどの論文がfull lengthを使っていることと、そのfull lengthのN末端にFlagやHAなどの小さいTagをつけたものをみつけたので、いけるかな？と思ってmouseHMGにくっつけました。 また、今でもfull lengthをとってこようと努力しているのですが、 なかなかうまくPCRがかからず、mouseHMGのみという安易にPCRがかかった 方に流れてしまいました。 誰かmouseHMGのリコンビナントについての論文など紹介してもらえないかと、密かに思っています。 B様のお話のように、Metの有無が実際に関与しているかどうか、 検証しないといけないような気がします。自分自身調べたといっても、 おそらく調べ方や、調べる量がまだまだ甘かったのだろうと思います。 もう一度、詳細を調べ実験計画をきちんと見直そうと思います。 実験への姿勢など的確なご指導ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.657-4 - 2008/02/11 (月) 23:20:26 - B ~さんが > >full lengthのN末端のATGははずして > 特に気にする必要はないと思います。 とおっしゃられていますが自分の目的としている蛋白質がmouseのHMGなら 既にたくさんのリコンビナント蛋白質がつくられ機能解析がなされて いると思います。せっかくですから過去の論文を確認してこの開始コドンで 付加されるMetがあってもなくても特に問題ないことを確認されては如何 ですか？ ついでにN末にFLAGが付いているベクターを使っているのはおそらく 既にそのベクターがラボにあったからでは？私もおそらくHMGでは 問題ないのではと想像していますが時々FLAGのような配列の位置が機能に 影響する蛋白質もあったりします。過去に機能的に問題ないことが確認 されているリコンビナントmouseHMGで同じようなコンストラクションが なかったか念のため確認されるといいと思います。大学院生1年生では その辺りかなり時間がかかると思いますが実験を計画する際に良く 調べる癖をつけておくことは今後のためになると思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.657-3 - 2008/02/11 (月) 09:50:10 - 停止コドン ~ 様 早い返信ありがとうございます。 周囲の誰に聞いても的確なアドバイスがもらえず、 困っていたので、本当にありがたいです。 また実験に対する考え方が未熟だったと自覚します。 >解析したいタンパク質の配列は何ですか？ mouseのタンパク質でHMG boxだけを増やす予定でした。 >停止コドンを入れていないということは、挿入した配列中では翻訳が止まらずに、ベクターのMCS辺りで止まりますよね。そこまでに追加された数アミノ酸がついたタンパク質の解析をしたいのですか？ 確かにMCSのアミノ酸がついてしまうので、心配していた構造変化など なんか自分で書いてることと矛盾してました。 停止コドンは入れるべきでした。 >停止コドン分の一つアミノ酸が増えたり、少なくとも哺乳類細胞や大腸菌の場合には、停止コドンにはアミノ酸は付きませんが、 genetic codeをみかえすと停止コドンにアミノ酸はついてませんでした。 たぶん誰でも知っていることに注意が足りませんでした。ありがとうございます。 >構造変化や、ベクターの配列由来のアミノ酸が付くことによる構造変化を無視できる根拠は何ですか？ 根拠は全くありません。この辺が研究者の姿勢として甘かったと思います。 >自然界にないものをつくるのではと、そもそも作ろうとしているタンパク質の一部分が自然界に無いものでは？これを理由に停止コドンをつけないというのであれば、タンパク質の一部分を作ること自体を止めた方がいいかと思います。 そのとおりだと思います。 >（full lengthのN末端のATGははずして）特に気にする必要はないと思います。 そうなんですか。気にせずATGつけた方が、ベクターの入れ替えの際に (FlagなどがC末端側についている場合：この場合は停止コドンはずそうと思います)プライマー新たに作らなくていいので、その方がCost的にも助かります。 丁寧に返信ありがとうございました。停止コドンをつけたプライマーの作成から再challengeしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.657-2 - 2008/02/11 (月) 07:13:11 - ~ 停止コドンを付けなければ、発現するタンパク質の配列はどうなると考えているのですか？ 解析したいタンパク質の配列は何ですか？ これらが分かっているのであれば、この疑問は生じないと思いますが‥ 停止コドンを入れていないということは、 挿入した配列中では翻訳が止まらずに、ベクターのMCS辺りで止まりますよね。 そこまでに追加された数アミノ酸がついたタンパク質の解析をしたいのですか？ >停止コドン分の一つアミノ酸が増えたり、 少なくとも哺乳類細胞や大腸菌の場合には、停止コドンにはアミノ酸は付きませんが、 停止コドンに何かアミノ酸が付くような種を材料に使っているのですか？ そうであれば、その種でのtruncateの解析方法の前例に従うか、停止コドンあり無しの比較が必要になるかと思います。 >構造変化や、 ベクターの配列由来のアミノ酸が付くことによる構造変化を無視できる根拠は何ですか？ >自然界にないものをつくるのではと、 そもそも作ろうとしているタンパク質の一部分が自然界に無いものでは？ これを理由に停止コドンをつけないというのであれば、タンパク質の一部分を作ること自体を止めた方がいいかと思います。 >細胞に導入してFlagの発現をWestern blotでみたのですが、 これは誰にも分かりません。 導入効率、そのタンパク質の一部分の発現のしやすさなどで発現量は変わってきます。 発現量の違いを一つの原因に落とし込むためには多くの実験が必要になります。 >full lengthのN末端のATGははずして 特に気にする必要はないと思います。

insertに停止コドンをいれるべきか、教えてください。 削除/引用 No.657-1 - 2008/02/10 (日) 20:13:11 - 停止コドン 大学院1年目で勉強しながら研究しているのですが、 疑問がなかなか解けず教えていただければと思いトピックを作りました。 よろしくお願いします。 発現ベクターに組み込んだ遺伝子に停止コドンを 入れたほうがいいかどうか教えてください。 ある遺伝子のfull lengthでなく、一部分だけPCRでとってきて、 N末端側にFlag-tagのついた発現ベクターにLigationしました。 Flagの頭には開始コドンがありますが、PCRでとってきた部分に 停止コドンはありません。停止コドン分の一つアミノ酸が増えたり、 構造変化や、停止コドンを無理やり入れて自然界にないものを つくるのではと、あえて停止コドンを抜いてしまったのですが、 このような場合、停止コドンは入れたほうがいいのでしょうか？ 普通は停止コドン入れるのでしょうか？入れないのでしょうか？ 細胞に導入してFlagの発現をWestern blotでみたのですが、 周りの人よりFlagの発現が弱いです。 停止コドンがないことが、影響しているのでしょうか？ （周囲はみんなfull length入れていて、停止コドンはありますが、 今回のように遺伝子の一部分のみ入れている人がいないので、みんな あいまいな答えしかもらえません。） またもう一点、full lengthを入れる際に、N末端にFlagがついている場合、 Flagの頭にATGの開始コドンがあるのですが、 full lengthのN末端のATGははずして導入したほうがいいのでしょうか？ というのも、ATG-----ATG----になると融合蛋白にならなかったりする のかと考えたりしたのですが、いかがでしょうか？ 上記について教えていただければありがたいです。よろしくお願いします。

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