全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございました 削除/引用 No.656-8 - 2008/02/27 (水) 16:44:26 - くりくりん ようやくconstructionが完成しました。 やはりフェノクロ処理ではうまくいきませんでした。 最終的にゲルの切り出しには長波長UVを用い、新たに購入したQIAEXII gel extraction kitにてvectorを精製しました。 ligationのvector:insertは300ng:100ngで問題ありませんでした。 transformationもelectroporation用competent cellを使用しました。 御教授いただいた皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.656-7 - 2008/02/12 (火) 11:44:52 - ats もう一つtipを... cohesive ends ligationの場合、vectorとinsertを混ぜて酵素を入れる直前に、65C 1分＞急冷を行うと、vector同士の結合(anealing)が外れて、ligation効率が2倍以上になることがあります。 通常のsubcloningでは必要ないですが、libraryを作製するときは常用しています。 また、長いDNAの時は、ligation液の混合やcompetent cellとの混合時には優しく扱った方が、効率が良い気がします。

(無題) 削除/引用 No.656-6 - 2008/02/12 (火) 11:34:04 - ＵＶ お話を聞けば聞くほどＵＶのせいだと思います。私たちが通常使うrecA-の大腸菌だと、プラスミド中にピリミジンダイマーが一つあるだけで形質転換能が失われます。短いフラグメントだとピリミジンダイマーが一つも入らない分子が沢山残るような条件でも、長いフラグメントだとてきめんです。 ベクターが大きいため、とお書きになっていますが、ベクターのサイズと切り出しの必要性とは関係ないのでは。このケースだとベクターの消化後、フェノール抽出とエタノール沈殿で精製するだけにすれば問題は解決すると思います。

ありがとうざいます 削除/引用 No.656-5 - 2008/02/12 (火) 11:23:35 - くりくりん 早速のご回答ありがとうございます。 ~さま > 16kbのPACの骨格部分を扱っていたときは、QIAEX II で取れていました。 > 確か、収率は1~5割程度だったと思います。 10ugのvectorを制限酵素処理し（1cutです）泳動して上記のキットを用いた 精製を行うとfinal 0.4ug位になってしまいます。 キットが古いせいもあるのかもしれないのですが。。。 > そのサイズであれば、エレクトロポレーションをしていますよね？ 実はchemical competent cellを使っています。 以前同じようなconstructionを行っていたとき自前の electro competent cellを用いてみたのですが形質転換効率が悪く chemical competent cellで無理やり取ったということがありました。 今回chemical competent cellを購入してみようと思います。 お勧めのメーカーなどありますでしょうか？ > サイズの小さい何が取れたのですか？ 恐らくvectorのデリーションしたものだと思われます。 atsさま > UVを長く当てていませんか？ 通常のconstructionでは問題が無いので、 なるべく短い時間でlevel lowのUVにて切り出しています。 次回は長波長のUVを使って切り出そうと思います。 Bさま > バックグランドのコロニーは得られていますか? insertありのligationで得られるコロニーが1個2個なので vectorのみではコロニーは現れません（もちろんCIAP処理はしてありますが） > もしそれでも上手くクローンが得られないのであればインサートと > ベクターの比を数ポイント広めにとってみては? いつもvector:insertを300ng:100ngで行っています。 次回はいくつか比を変えてみます。 みなさまのご意見を参考にしてもう一度チャレンジしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.656-4 - 2008/02/11 (月) 22:32:15 - B バックグランドのコロニーは得られていますか? もしコロニーが全く得られないのであればatsさんが言っている様に UVを確認するべきです。以前波長を間違えて使っていたために数ヶ月 無駄にしました。 もしそれでも上手くクローンが得られないのであればインサートと ベクターの比を数ポイント広めにとってみては?私の場合は極端に 短いインサートのライゲーションですが数ポイント振らないと 目的のクローンが得られませんでした。

(無題) 削除/引用 No.656-3 - 2008/02/11 (月) 11:53:14 - ats UVを長く当てていませんか？ EtBr染色したゲルからDNAを切り出す場合、長波長(360nm)のUVを使用しできるだけ短時間の照射にしましょう。最近のゲルイメージャー（撮影装置）は感度を上げるため短波長のUVランプを使用しているため、DNAへのダメージは大きく切断・変異が入りやすいので注意が必要です。 切り出し用のDNAの染色は、感度は悪いけどNile Blueが安価です。

(無題) 削除/引用 No.656-2 - 2008/02/11 (月) 06:33:44 - ~ 16kbのPACの骨格部分を扱っていたときは、QIAEX II で取れていました。 確か、収率は1~5割程度だったと思います。 収量が悪いというのは全く取れていないということでしょうか？ ライゲーションに使うには1ngもあれば十分だと思いますが‥ ライゲーションの条件の振り方か、トランスフォーメーションのやり方に問題があるような気がします。 そのサイズであれば、エレクトロポレーションをしていますよね？ >サイズの小さいものばかりでやはり目的のものは取れませんでした。 サイズの小さい何が取れたのですか？ 　1kbの方の切り出しがうまくいっていなく、ベクターがコンタミしたか、 　全く無関係なベクターのコンタミか、 　14kbのベクターのデリーション 辺りが原因で、それぞれ対応方法がかわってくると思いますが。

大きいベクターへのサブクローニング 削除/引用 No.656-1 - 2008/02/10 (日) 19:07:33 - くりくりん 現在14kbのvectorに約1kbのfragmentを挿入するconstructionを行っています。 vector sizeが大きいため制限酵素で切り出し、泳動後QIAGENのQIAEX II Gel Extraction Kitにて精製していますが収量が悪くligationをしても目的のものは取れてきません。（QIAquick Gel Extraction Kitは10kb以上のDNAには適用できないようなので前記のキットを使用しています） キットが良くないのかと思い、泳動をせずにフェノクロ、エタ沈でもやってみたのですが収量は悪くないもののサイズの小さいものばかりでやはり目的のものは取れませんでした。 何度かやってみているもののうまくいかないので皆様が使用されている精製方法やコツなどありましたらご教授いただければと思っております。 どうぞよろしくお願いいたします。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---