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(無題) 削除/引用 No.651-5 - 2008/02/09 (土) 21:23:04 - ~ 3kbをflagment A, flagment Bに制限酵素X?で切断して、 それぞれをクローニングしてからくっつけた方が効率がいいような気がします。 3kbをPCRで増やす　(又は、それぞれのフラグメントを別々にPCRで増やす) ↓ 制限酵素Xで切断し、両側をそれぞれ切り出す ↓ 適当なベクターにクローニング（例：pBS-flagment A, pBS-flagment B) ↓ 片方はインサートを入れるために1cut(又は末端を合わせるために2cut)、もう片方はインサートを切り出す ↓ ライゲーション で今行おうとしているものと同じものを取ってこれると思います

(無題) 削除/引用 No.651-4 - 2008/02/09 (土) 18:01:48 - 中年 両端がcompatibleな直鎖状DNAをライゲーションしたら、お望みの環状化分子だけでなく、２分子、３分子、・・・とライゲーションされる訳ですから、それをゲル電気泳動したら各バンドはずっと薄くなりますよ。そのせいで見えないのではないですか？自分自身とライゲーションされる分子の割合を増やそうと思ったら、かなり希薄なDNA濃度で反応することになります。

ありがとうございます 削除/引用 No.651-3 - 2008/02/09 (土) 17:00:24 - 困った 早速にご連絡ありがとうございます。まずLigaseあるなしでIncubateしてみます。ちなみにウイルスの環状DNAで、ちょうどプライマーの部分をリニアにする必要があり、PCRしたLinearなDNAをLigaseで環状にして、反対側を切断してプラスミドにLigateする予定ですが、最初のLinearなDNAをCircularizeするところでDNAがなくなっているのです。

(無題) 削除/引用 No.651-2 - 2008/02/09 (土) 12:31:12 - ~ サンプルや目的やコントロールの結果について書かれていないので、 その結果が適当かどうかもわからないのですが、 これは単なるプラスミドの構築でしょうか？ ligaseを入れないサンプルを同時にインキュベートすることで、 精製したDNAにDNaseがコンタミしているか、ligaseが悪さをしているのかが分かります。 ｐBSなどをEcORIか何かで切ったフラグメントをポジコンとしてライゲーションさせることで、反応条件に問題があるかを調べることが出来ます。 プラスミド構築であれば、見えない量であってもトランスフォーメーションは可能だと思います。

リガーゼ反応でDNAが消える 削除/引用 No.651-1 - 2008/02/09 (土) 10:56:31 - 困った 3kbのDNAを抽出して、これをCircularizeするためにT4DNALigaseで反応させました。16度18時間。その後これをゲルに流してみると、下のほうにぼんやりしたごみのようなものが写るだけでDNAのバンドが消失していました。Ligase反応前にはゲル抽出してバンドが確認できています。何が起きたのでしょうか？ご教示いただけると幸いです

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