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nonさん 削除/引用 No.649-5 - 2008/02/13 (水) 19:32:50 - akane お返事ありがとうございます。 アナライトには分子量1kDaの合成ペプチドを随時調整してます。 リガンドには43kDaのタンパク複合体を使っています。 ２価以上になることはないとは思いますが、自分でリフォールディングしたタンパクで、構造がはっきりわかっているわけではないのでなんともいえません… ではほんとに厳密にタンパクの固定化量を合わせないと反応が変わってくることがあるのですね！ただつけただけでOKということでもないのですね！ 試してみます。 周りに知識のある人がいないもので、相談できず困っていました。 大変参考になりました！ どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.649-4 - 2008/02/13 (水) 10:47:20 - non 1.のご質問に対して・・・ アナライトが複合体であったり、アグリゲートしていたりすると 理論値より高い数値を取ることがあります。 また、リガンドがアナライトに対して2価以上ということはありませんか？ アナライトとしてクルードサンプルを扱っている場合には、 予想以上に非特異吸着があります。 細胞培養上清をアナライトとして使ったときには、 かなり大きな非特異結合に邪魔されてしまいました。 希釈率を上げることで対応しましたが、 特異的に反応する因子の濃度が低い場合には希釈では対応できないかもしれません。 2.のご質問に対して・・・ リガンドの分子量によるとも思いますが、 沢山キャプチャーさせすぎたため、立体障害が起きて(?) アナライトの結合量が上がらなかったという結果が出たことがあります。 自分が扱った印象ですが、 結合速度定数・解離定数の算出を目的としているのであれば 割と厳密にリガンド(キャプチャー)の量を調整する必要があると思います。 BIAcoreは、機器の操作自体は簡便ですが、測定条件の組み立てがとても大変でした。 周囲に経験者がいるのであれば、実際に聞いてしまうのが得策かもしれません。

HIs-Tagさん 削除/引用 No.649-3 - 2008/02/12 (火) 00:01:26 - akane お返事ありがとうございます。 一応、反応が違うと思われる３種類のアナライトを使ってみていて、反応性に違いは生じています。 そのうち１つに関しては70RUほどだったのですが、他２つは両方とも250RUを超える値でした。 大きくかわることもあるし、ないかもしれない… そうですよね。 昔、BIAcoreは再現性があまりとれないという話を聞いた事があります。 それは結合したリガンドが死んでいるか生きているかがよくわからないから、ということですね。 どうもありがとうございました。 とりあえずはリガンドの固定化をきちんとやるべく、検討していきたいと思います。

なんともいえませんが 削除/引用 No.649-2 - 2008/02/11 (月) 20:24:50 - His-Tag SPR は非常に便利だけど、解釈が難しいですよね。 １については、アナライトが潤沢に準備できるならば反応が飽和するであろう濃度をアプライして、本当に予想通りの飽和を示すセンサーグラムが得られるか確認してはいかがでしょうか。固定化量から予想される結合量を平気で超えるような結合を示す場合は、「その条件では」特異的な結合をしているとはいえないでしょう。逆に、条件次第では、本来の結合を示す可能性も捨てきれません。 または、アナライトとリガンドの結合を阻害する抗体との競合阻害などの呼び実験があると説得力が増すと思います。 また、アナライトをまったく関係ないものにして同様の実験をしても同じセンサーグラムが得られたならば、特異的な反応を疑ってもいいかもしれません。 ２については、リガンドを 1000 RU 固定化したとしてもそのリガンド分子すべてが生きているかどうかはわからないので、だれも保証できないと思います。 １の質問とも関連しますが、固定化方法も視野に入れつつ検討するべきです。 結論からいうと、大きく変わることもあるし、ないかもしれません。 あまりクリアなお返事になってませんがご参考になれば幸いです。

BIAcore測定の結果について 削除/引用 No.649-1 - 2008/02/08 (金) 21:50:16 - akane はじめて書き込みさせていただきます。 BIAcoreを使い始めたのですが、質問が２点浮上しました。もしわかるかたいらっしゃったらご助言お願いいたします。 １、リガンドの固定化量に比べてアナライトの反応が大きすぎるのですが、これは特異的に結合してないからなのでしょうか？（計算では70RUほどなのに、200RUを確実に超えます） ２、リガンドの固定化量が1000違えば当然アナライトの反応もそれなりに大きく変化するものですか？それともリガンドの種類によってアナライトの数値が決まるのでしょうか。 初歩的な事かもしれないですが、教えて頂ければ嬉しいです。

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