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(無題) 削除/引用 No.644-6 - 2008/02/14 (木) 18:34:04 - mimi DTTやメルカプトエタノールは、重要ですね。 どの酵素を使う時も入れることをお勧めします。 (酵素のマニュアルなどにバッファー組成など 記載がありますので、参考にしたらいいです。) あと、書き忘れてましたが中和後にCIAAなどで 精製してからカラムにかけると純度が上がり 形質転換効率も上がるようです。

ありがとうございました 削除/引用 No.644-5 - 2008/02/13 (水) 12:31:49 - ＴＸ mimiさん 詳しい実験方法お教えいただきありがとうございました。 クローンも多く、キットも高いので参考にさせて頂きます。 念のため、キットの方も弘法さんの指摘で、 溶菌の工程に問題があると考えられましたので、 実験方法を改良しやり直しました。 lyticase処理時に新たにDTTを添加し、 その一部をSDS処理し溶菌確認をした上で、 実験を進めたところ、菌体量多い少ないに関わらず、 十分なプラスミドを回収することができました。 mimiさん、弘法さんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.644-4 - 2008/02/12 (火) 12:10:54 - mimi 1.LEU-培地上で、直径5mm程度のパッチ（スポット）を作って、RNaseを 　加えたZymolyase溶液(Litycase可)250ulに懸濁して、1時間細胞壁を 　消化します。(シェイカー付きのインキュベーターにいれるのが楽です。 場合によっては消化を検鏡で確認） 2.これを普通のアルカリプレップのSolutionI(菌体懸濁液)として使って、 　プラスミドを精製します。(カラム型が楽かもしれません。) 3.十分量の水で溶出し、脱気濃縮してから大腸菌に形質転換します。 　コンピテントセルに10^8の効率があれば、50-100程度のコロニーが 　翌日生えてきます。 ★20ng/ulと書いてありますが、プラスミド以外に酵母ゲノムが混じる 　ことも多いです。(量が採れてれば問題ない) ★エレクトロポレーション用に、精製もかねてエタ沈するときは 　共沈剤を忘れずに。 ★形質転換した菌体はすべてまく。コロニーの重複はあまり関係ないので 　形質転換後のインキュベートを少し長めにとっても良い。

(無題) 削除/引用 No.644-3 - 2008/02/08 (金) 16:03:23 - ＴＸ 弘法さん お返事ありがとうございます。 そうですMATCHMAKERのbaitとpreyのプラスミドです。 QTO/b-gal合格コロニーから、プラスミドを取得し、preyのinsert primerを用いてinsertを増幅させ、増幅産物をゲル抽精製し、シークエンスして興味あるもののみ大腸菌に導入させようと考えています。 上手くいった最初は、コロニーの極少量をつっつき,litycase１ｈ処理、SDS処理凍結溶解処理を施し、カラム精製し、20ng/μlのプラスミドを取得できていました。 予備実験でこのプラスミドをエレクトロポレーションで大腸菌に導入したところ、3コロニー程度形質転換体を得ることが出来ました。 もっと大腸菌の形質転換体が得られないかと思い、コロニーの回収量（突っつく量を増やしたり、コロニーを液体培地で一晩培養）を増やした所、上手くいかないことが多くなりました。 うー、こう冷静になって書いてみると、欲張りすぎて持ち込む菌体量が多くなり、溶菌できていない可能性が出てきましたね(汗）。

(無題) 削除/引用 No.644-2 - 2008/02/08 (金) 15:06:41 - 弘法 そのキットを使ったことはありませんが、エレクトロポレーションを使っても形質転換体が得られないというのは、何かがおかしいと思われます。 単離しようとしているプラスミドは、クロンテックのtwo-hybrid用のものでしょうか。だとしたら、これらは酵母の中で高コピー数のものなので、これで収量が低すぎるとしたら、菌体量が少なすぎるか、Lyticaseによる溶菌が不十分であることが疑われます。マニュアルにチェック法が書いてあると思います。

yeast plasmidの単離 削除/引用 No.644-1 - 2008/02/08 (金) 11:19:21 - ＴＸ 現在、yeast からyeast plasmid isolation kit(clontech)を用いてプラスミドの単離をおこなっています。 しかしながら、クローンによっては収量が低すぎて、エレクトロポレーション法を用いても大腸菌にプラスミドを導入することが出来ませんでした。 高額なキットを使ったわりに、上手くいかずがっくりきているのですが、 酵母の場合こんなもんなんでしょうか？

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