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ありがとうございます。 削除/引用 No.641-8 - 2008/02/29 (金) 16:13:38 - Working+Poor メチル化様 ご助言、ありがとうございます。 実は、この質問をしたのは2月初頭だったのですが、他に仕事が入り、 バイサルファイトシーケンスは後回しになってしまっています。 時が来たら、頂いたご助言を踏まえ、がんばってみます。 上手くいかなかったら、また質問させていただきます。 その時も、どうぞよろしくお願いいたします。 Working Poor

(無題) 削除/引用 No.641-7 - 2008/02/29 (金) 15:01:45 - メチル化 シーケンサーの機種にもよるのですが、 nonCGがCからT（U)に変わっていると、 Tのシークエンス部位が少ないためにシーケンサーが 自動処理をして少ないTの部分の波を大きくとることが あります。 しかし、通常の片alleleのmutationのように小さい波に なるのが普通と考えられます。 まずは、Sss�T処理したDNAを使用して、制限酵素で完全に切れるか どうか見ることと、それが実際に使用しているシーケンサーで どのように見えるかを見てもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.641-6 - 2008/02/09 (土) 20:39:41 - Working+Poor 通りすがり様 早速のご返答、ありがとうございました。 とても助かります。 教えていただいた通りにやってみます。 このサイト、すばらしいですね。 私も、このサイトをちょくちょくチェックして、 誰かのお役に立てるようにがんばります。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.641-5 - 2008/02/09 (土) 07:55:38 - 通りすがり >私は、キアゲンのDNeasyを用いました。 >その後、取れたＤＮＡをEcoR1,BamH1で切断し(変換効率が上がるとの情報か >ら）、フェノクロ、エタチンしました。 基本的にはどのような精製法でもよいのですが、 タンパクを除去するstepを繰り返したり、 カラムを使用する場合はEtOHなどによるWashの回数を増やすなどの 工夫が有効です。 もしくは一度精製したものをもう１，２回 最初からカラムなどに吸着させて 精製しなおしたりすることでも改善されることがあります。 フェノクロなどの場合は、SDSを適量加えてタンパクの変性などを促進させてからクロロホルムを混ぜないフェノールのみで２回ぐらい抽出した後に フェノクロ抽出をするとより綺麗にとれます。 最終的な収量は落ちますが、純度のほうが大事です。 >また、DNAの高次構造については、そのように調べていらっしゃいますか？ >フリーのツールがあったら、教えていただけないでしょうか。 フリーならばM-foldが代表例でしょう。 http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cg 目的の領域付近をペーストして予想される構造をcheckして 2次構造がtightならば少しずつtargetをずらしていき、安全そうなところを選ぶのが無難でしょう。

Working Poor 削除/引用 No.641-4 - 2008/02/08 (金) 09:44:05 - Working+Poor 通りすがり様 コメント、どうもありがとうございました。 とても助かりました。 世の中、親切な方がいるものだなぁと見直しました。 自分も、そうありたいと思います。 ずうずうしのですが、もう少し教えてください。 ＤＮＡ精製について、通りすがりさんは、 どのような方法でなさっていましたか？ 私は、キアゲンのDNeasyを用いました。 その後、取れたＤＮＡをEcoR1,BamH1で切断し(変換効率が上がるとの情報から）、フェノクロ、エタチンしました。 また、DNAの高次構造については、そのように調べていらっしゃいますか？ フリーのツールがあったら、教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.641-3 - 2008/02/07 (木) 18:07:26 - 通りすがり >経験者の知り合いが無く、この結果が通常なのか、問題があるのか、 >通常だとして、無変換の程度はどのくらいまでゆるされるのか、 >問題があるとして、どのように解決したらよいか、分からず困っています。 経験者です。 対象の生物が哺乳類であると仮定して話を進めます (植物だとnon-CpGのメチル化があるので) 結果から言うと問題が大いにあります、 というかむしろnon-CpGの変換を指標にして効率をcheckするのが 通常ですので反応系そのものがうまくいってないのです。 論文を投稿する際などにおいて、レフリーからnon-CGがほぼ全て変換されており実験の系が正しいことを示すため、生のSequenceのdataを要求され、non-CGのCがseqのdataに残っていない(Tに変換されている)ことをcheckされることがたまにあるぐらいですので。 >通常だとして、無変換の程度はどのくらいまでゆるされるのか、 (明文化されたガイドラインはたぶんないですが)、 約99.5%以上(10~15以上のclone由来のseqeunceから)の non-CpGのCがTに変換されてることが Bisulfite反応が正しく行われてるひとつの信頼できる目安という風に メチル化関係のcommunityでは暗黙の了解のようなものになってます >問題があるとして、どのように解決したらよいか、分からず困っています。 経験上、原因はほとんどの場合ゲノムの精製度や高次構造に問題があることが多いです。試薬や反応の手技的な部分も原因にはなりますが、まれです。 Bisulfite添加時において一本鎖になりずらいDNA領域であり、また余計なＤＮＡ結合タンパクなどの阻害物がDNA上に残存している時に、Bisulfite反応が数十bpから100bp程度のブロック上にnon-CpGが変換されないことがよくあります。 通常の精製時よりも精製度を上げる工夫と、ヘアピンなどの高次構造がないことを確認し、もしもあればそのような高次構造領域を避けた部位でprimerを設計すれば解決するでしょう。

バイサルファイトシーケンス　無変換Ｃ 削除/引用 No.641-1 - 2008/02/07 (木) 16:15:31 - Working Poor ご存知の方、助けてください。 よろしくお願いいたします。 DNAメチル化解析のため、バイサルファイトシーケンスをしています。 シーケンス結果を見ると、Ｔに変換されているはずのＣ(CpGでない)もＣのままであるところがかなり多くあります。 経験者の知り合いが無く、この結果が通常なのか、問題があるのか、 通常だとして、無変換の程度はどのくらいまでゆるされるのか、 問題があるとして、どのように解決したらよいか、分からず困っています。 ご存知の方、助けてください。 バイサルファイト処理は、Human Genetic Signatures社のMethylEasyを用い、16時間行いました。 PCRはNestedをしなくてもバンドがでたので、それを用いました。 増幅長は約250bpです。 プライマーにはCpGは無く、ForwardのCはTに、ReverseのＧはAに変えてあります。 ご存知の方、助けてください。 よろしくお願いいたします。

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