全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

Arginineいいらしいです。 削除/引用 No.639-12 - 2008/02/23 (土) 10:11:01 - 封入体 封入体みたいに溶けないやつを溶かすのに高濃度アルギニンがいいらしいです。これだと、よくある透析して抜いたらまた沈殿、みたいな事も少ないらしいです。この方法は蛋白質を変性させずに可溶化するのでリネイチャーとかに神経使わないですみます。

例えば 削除/引用 No.639-11 - 2008/02/16 (土) 18:31:07 - f 私の場合、複合体で安定化する酵素に対し、 可溶化能の高い基質を融合させて、可溶性タンパクを得ました。 in silicoさんが聞きたかったのはそのような例では？と思ったのですが、、 うまくいくかどうかは試してみないと判らないと思います。 因みに上記の例では既出のタグをひと通り試してもほとんどとれず、 発現領域や融合させる順序、リンカーの長さ、精製タグの種類および 位置などを検討するのに二年近くかかりました。

(無題) 削除/引用 No.639-10 - 2008/02/15 (金) 22:27:54 - NF Aさんのおっしゃるようなことを以下の順ですべてやてみます。 １．発現条件の再検討（IPTG濃度、温度、発現時間など） ２．シャペロン蛋白との共発現 ３．新しいコンストラクトの作成（今回の場合は、TrxやNusで試します） ４．リフォールディング（酵素であっても、リフォールディング後に活性があれば使用できるのでは？） これだけやっても精製する価値がある実験かどうかは、in silicoさん次第だと思います。 この酵素が今までに無い新規な酵素で、この酵素の解析がメインのプロジェクトであれば、どんな手を使っても精製までこぎつけるように工夫します。一方、新規といっても種が違うだけ（例えば、大腸菌由来の酵素は解析されていて、今回は枯草菌由来といった場合）はもっと精製しやすいものを選びます。また、この酵素をただの道具として使うだけの場合も、あきらめて別の方法に移ります。 あきらめる場合は、早めに見切りを付けた方が（半年〜１年？）今後のプロジェクトを早く始めることが出来るとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.639-9 - 2008/02/14 (木) 23:24:04 - qq あなたのタンパク質の由来する種は何ですか？ あなたのタンパク質は、その生物中で、可溶性なのですか？ バキュロに移すことや、動物細胞で安定発現させることは考慮していますか？ こんなことを考えて、止めるかどうかを決定します。

返答ありがとうございます 削除/引用 No.639-8 - 2008/02/14 (木) 20:55:43 - in silico う〜んと さん A　さん さとし　さん 茄子　さん とも　さん かじ　さん 参考になるご意見ありがとうございます 皆様が仰られている事を検討していくことが適切であると思います。 しかし私が扱っているタンパクは、酵素であり可溶性タンパクにする目的でリフォールディングできればOKというものではないと考えております。 タグ兼目的タンパクの可溶化向上するようなもののC末に発現させることが妥当だと考えております。 GSTやTrxなどタグとしても利用可能なタンパクではなく、可溶性にすることを重視するタンパク（精製時に切断する）と発現させてはいかがなものかと考えております。 調査不足でありますが、GSTやTrxというのはタグとしても機能する可溶性タンパクなのでしょうか？ それとも、検討の中で排出されたタンパク精製に最も有効なタンパクなのでしょうか？ もし前者ならば、自分の研究室で精製している可溶化に優れるタンパクのC末に目的タンパクを発現させてみてはいかがなものかと考えております。 別件になってしまいますが、目的タンパクがうまく精製されない場合、プロジェクトを断念するのか、色々な知識を駆使しながら精製までこぎ着けるのか、皆様はどのようにされているのかお聞きしたいです。 よろしくお願い致します

可能であれば… 削除/引用 No.639-7 - 2008/02/12 (火) 17:30:21 - かじ 私も、ともさんの意見に賛成です。 まず、Urea（我々のラボでは、８MのUreaで可溶化していますが）で可溶化して、その後、透析でUreaを除きます。 このときに、目的蛋白が凝集しなければ、そのまま、GSTのカラムにかければいいと思います。 運悪く、凝集してしまったら、カラムにはかけられないので、Tagを変えますね。 His-tag系であれば、Ureaで可溶化した状態で、カラムにかけられますし、その後、透析して、目的蛋白を精製する方法があります。 ただ、確かに、Aさんが言われているように、リフォールディングするかどうかが、問題ですが。

(無題) 削除/引用 No.639-6 - 2008/02/12 (火) 13:57:35 - とも 大腸菌を5Mウレアでペレットごと溶かし、ゆっくりウレアの濃度を減らして透析。 タンパクが溶化しているときのウレアの最低濃度を決めて精製。 シャペロンとか温度とかいろいろやったけど、一番うまくこの方法がいったかな。バキュロの系（昆虫細胞）でもうまくいくときがあるらしいですよ。 昆虫細胞使うと可溶化しやすいらしいです。理由はわかりませんが。 あるメーカーの人が言っていました。

(無題) 削除/引用 No.639-5 - 2008/02/09 (土) 18:14:14 - 茄子 さとしさんの挙げておられるTrxやNusは、融合タンパク質が可溶化しやすいという触れ込みではありますね。どこまで有効かはタンパク質に拠りけりでしょうが。下記のサイトには次のようにあります。 大腸菌内で通常不活性な状態で産生される多くのタンパク質は、N末端チオレドキシン（Trx・Tag）配列と融合すると更に可溶化しやすくなる傾向があります（La Vallie et al., 1993; Novy et al., 1995）。pET-32a-c(+)ベクターから発現したTrx・Tagは、多くの目的タンパク質の可溶性を高めるだけでなく、trxB変異株の細胞質内にジスルフィド結合の形成を触媒するようです（Stewart, 1998）。 pET-43.1a-c(+)およびpET-44a-c(+)ベクターにより、可溶性促進ペプチド、Nus・Tagを組込むことができます。Nus・Tagは、過剰発現時に最も可溶性の高い大腸菌タンパク質を系統的に探索して開発したものです（Davis et al., 1999; Harrison, 2000）。4つの異なるNusA融合タンパク質をそれぞれ用いたテストでは、目的タンパク質の85％以上が可溶化しました（Harrison, 2000）。 https://www.cosmobio.co.jp/support/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-5-A_20040518.asp

たとえば 削除/引用 No.639-4 - 2008/02/08 (金) 22:10:28 - さとし ”GST融合タンパク質でうまくいっていないので、ダメ元なのですが” など、理解されておられるようですし 他の選択肢として一般的にどういうものがあるか。と言うことですか？ MBPの他には、TrxやNusなどもあります。 大腸菌の株をかえるのも手ですね。

(無題) 削除/引用 No.639-3 - 2008/02/07 (木) 20:02:47 - A う〜んとさんもおっしゃられていますがin silico さんがおっしゃら れているような方法で一番使われているのはGST融合蛋白質です。 他に考えられる目的の蛋白質を可溶化する方法は １．リフォールディング ２．シャペロン蛋白との共発現 ３．発現条件の再検討（IPTG濃度、温度、発現時間など） ４．新しいコンストラクトの作成 などです。１．はリフォールド後に活性が測定できるアッセイなどが あることが前提です。また４．に関しては例えば目的の蛋白質が全長で はなくドメインでも機能することがわかっているのであればドメイン レベルで発現させる。またほぼ全長発現であっても１-２アミノ酸が 短くなるだけで蛋白質の安定度が劇的に変わることがままあるので それを期待して機能を失わない範囲で長さの異なるコンストラクションを 幾つかつくってみることです。あとは思い切って違ったタイプの発現 ベクターにコンストラクトしなおすのも手です。最近は既存の発現ベクター が上手くいかないときはタカラのコールド系のベクターに移行する場合が 多いようです。

(無題) 削除/引用 No.639-2 - 2008/02/07 (木) 15:45:34 - う〜んと GSTは可溶性タンパク質なので、ご質問の内容はすでにご自身でやっておられることになります。 ただ、タグたんぱくを別のもの（たとえばMBPとか）に変えたり、スペーサ配列を変えたりする試みは有効な場合もあるようなので、そういった方向性で検討されてはいかがでしょうか。

不溶性タンパクの可溶化方法 削除/引用 No.639-1 - 2008/02/07 (木) 15:17:42 - in silico いつも勉強させて頂いております 早速ですが、相談させて下さい 私の目的タンパクはGST融合タンパク質としても、ほとんど不溶性タンパク質となってしまいます。 そこで、既存の可溶性タンパク質融合タンパク質としたら自分の目的不溶性タンパク質も可溶性タンパク質になるのではないかと考えました。 そこでインサートを(既存可溶性タンパク質 factor Xa 目的タンパク質)などと設計しタンパク質発現したら、不溶性タンパク質も可溶化しないかなと思いまして、もしこのようなことをやられた方がいれば、うまくいったかなど情報を頂けないでしょうか？ GST融合タンパク質でうまくいっていないので、ダメ元なのですが 隣であれだけ可溶性タンパク質をとられると、何か恩恵を受けられたらと思えてなりません

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---