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(無題) 削除/引用 No.638-22 - 2008/02/16 (土) 22:44:51 - 原核屋 以前に低コピー数でのPCRの話題が出ていたので、 定量PCRの場合に当てはめてみると、 低発現量のmRNAでは、かなりのばらつきが出ることがわかります。 例えば、1サンプルあたり10ng程度のcDNAをPCRに用いる場合、 mRNA由来のcDNAが1ng程度で、 mRNAが10000種類発現している場合、平均100fgがテンプレートになります。 しかし、mRNAの発現量に最大1000倍程度の差がある場合には、 最低発現量を示す遺伝子では、0.1fg程度しかテンプレートがありません。 これは200コピー程度です。 この場合、ピペットで10ng分のcDNAをはかりとったときに、 きちんと200コピー分の目的遺伝子が入っていなければ、 再現性のある結果が得られません。 ですから、ピペッティング前に十分にボルテックスにかけるなどして 溶液の均質化を常に行わないと、ピペットではかりとった体積が正確でも PCRの再現性が得られないことになります。 また、運悪くボルテックス時に損傷して増幅不可能になるテンプレートも あるかもしれませんが、塩濃度の高いPCRバッファー中で スピンダウンした場合にテンプレートが沈澱してしまう可能性 などと比べると、結果の再現性に与える影響は低いと思います。

(無題) 削除/引用 No.638-21 - 2008/02/15 (金) 11:27:22 - う〜んと 議論を見守ってましたが、筋はどこへ？ 思いついた点を挙げてみます。 重複していましたら失礼。 経験的には反応条件の最適化が行われていないと、再現性が悪くなります。 複数のプライマーセットで同時に測定する場合には、サブオプティマルな条件にならざるを得ませんが、プライマーの配列毎に最適化を検討してみることをお勧めします。複数セットでの同時測定が必須であれば、プライマーの再検討が必要かも。 プライマーが独自デザインで保存期間が長かったり、凍結融解が頻繁だったりすると品質が劣化し、測定結果に影響を及ぼしてトラブルの原因になります。 腕の問題は確かにあって、ピペッティングエラーが大きい場合にはROX補正をかけられないシステムでは厳しいです。測定結果を評価するために、実験者の腕の誤差範囲を求めるための測定も必要でしょう。 ピペットチップのメーカー、ロットによっても液切れが随分違うので比較評価は作業効率の向上に重要です。

(無題) 削除/引用 No.638-20 - 2008/02/15 (金) 10:15:30 - K24 特に、フィルター付のチップについては他の人もわかっており、それを改善するように手は施しました。 プライマーは前任者が使用していたもので、濃度、温度のオプチマイズは行なわれていません。 プライマーダイマー（小さいピークが低濃度に)は、時々目にしていました。しかしながら、1度に10検体以上測定したときに、すべての10検体で認められるわけではなく、一部、不特定のサンプルに見られる現象でした。 プライマーダイマーの不特定出現が頭にあったので、質問してみました。 手技の問題も多く残っていると思います。 たまたま得られていたばらつきのないデータはまぐれなんだと思います。

(無題) 削除/引用 No.638-19 - 2008/02/15 (金) 09:16:29 - R プライマーダイマーかどうかは、 　melting curveをみる 　電気泳動してsizeを確かめる で簡単に確認できます。 しかし、そもそもピペッティングして目で見て 液量が違うなら、腕が悪いのが一番の原因でしょう。 ABさんのご質問に対しては 短い方が増幅効率がよくなり デルタ/デルタCt法で半定量できるようになります。

(無題) 削除/引用 No.638-18 - 2008/02/15 (金) 06:32:39 - arara >ばらつきがないときでは、Bioradと同じような結果を出していましたので、問題なく使っていました。 これを聞いて，以前はきちんとした結果が出ていたと思ったりもしてたのですが，「（たまたまばらつきがなかった時には）Bioradと同じ…」とも読めますね． 同じ機器，同じ試薬，同じ道具を使って問題ない方がいらっしゃるのならば，通りすがりさんのおっしゃることが原因としてもっともなのかもしれません． realtime PCRを実施するに際し，自分の使っているプライマーがダイマー形成するか否かを知らないというのも姿勢としてどうかと思いますよ．同じプライマーを使い続けたのかわかりませんが，ばらつき続けたにもかかわらず1年間一度も確認しなかったということでしょうか...

(無題) 削除/引用 No.638-17 - 2008/02/15 (金) 04:14:00 - AB Real-time PCRは経験ないのですが、便乗で質問させて下さい。 Real-time PCRのprimerは、150bp程度の短い部分を選ぶことが多いようですが、 500bp程度の部分を選ぶと何か問題があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.638-16 - 2008/02/15 (金) 03:53:45 - 通りすがり 経験上この手の実験の失敗の原因として最も可能性の高いのは腕が悪いからです 何故かそれを疑わない人が大勢います それどころか真っ先に試薬や器具に原因を求め 既に世界中で一般的に使われるようになっている技術を 「つかえないな」 などと思ってしまう人が不思議にも大勢います 自分の腕と頭が「つかえない」と微塵も思うことなく 外に原因を求める人が沢山います 経験上そういう人は成長しないので何をやっても上手くいきません そのたびに外に原因を求めます 以上単なる経験則です

プライマーダイマー？ 削除/引用 No.638-15 - 2008/02/15 (金) 02:41:52 - K24 純正試薬を使用してもばらつきます。 ピペットマンは共同で使用しており、他の人はn=1のサンプルで何回か測定していても問題ないといっているので、ピペットマンではない可能性があります。 昨日、プライマーダイマーはどうかと思ってプライマー濃度を変えて行いました。これもばらついており何とも言いがたいですが、テンプレートなしでもCt値31-40でダイマーが起こっているのではないかと思っています。他に考えられるのはコンタミかもしれませんが。 プライマーダイマーの起こったときには、どのようなことから判断すればいいのでしょうか？ プライマーダイマーがばらつく原因になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.638-13 - 2008/02/12 (火) 14:17:58 - そば >ばらつきがないときでは、Bioradと同じような結果を出していましたので、問題なく使っていました。 機器に対応する純正試薬を使った時にもばらつきますか？ ピペッティングエラーという基礎的な問題を除いては、機器と試薬の相性問題はデータのばらつきを生じる大きな要因になります。 某社の方が嘆いてましたけど 「『誤差が大きくてRT-PCRなんて信用ならん』という苦情の多くは、当社の純正品以外をお使いの方がほどんどで、我々としては『まずは純正品をお使いください』としか言えないんですよ。はっきり言って、純正品を購入して頂いたお客様からはそういう苦情はぴたりと止むんですね。そういう話をしても『殿様商売しやがって』となってしまう場合もあるんですけど・・・」 だそうで。 ちなみに私も、純正品を使ってみたらぴたりと苦情が止んだ内の1人だったりします（同一サンプル、同一プライマーのtriplicateで0.5前後の誤差が出てたものが、純正品を使ったら0.1も誤差が出なかった）。 ただ、機器によっては必ずしも純正品が最適というわけでもないようで、純正品はベターな選択と思っておくのが無難。 （ちなみに上記のエラーの出やすい試薬でも、別の機器においては非常に良好な結果が得られます。結局、機器と試薬の相性が重要なのだと思います）。 RT-PCRは正確で広範囲な定量が出来る方法ですが、”最適な条件においてのみ”そういうことが可能な方法であるという点を甘く見ると、エラーが大きかったり、希薄溶液が定量出来なかったりという問題が発生します。 安い試薬はプレ実験の簡易定量用、純正品は本番定量用と割り切って使うと良いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.638-12 - 2008/02/12 (火) 12:13:46 - ぽすど君 > ホットスタートの酵素ですが、機械がホットスタートになっているのか疑問です。 > というのも、サンプルを挿入し、Lidを閉じてスタートボタンで開始。開始後、室温から95℃へと上昇しているからです(おそらく約2分程度)。 酵素がホットスタートに対応しているなら別に問題ないでしょう． > あと、フィルターチップを用いていると見た目でもう違う量採取しているときがあるので、それも変えたほうがよさそうです。 採取量がそんなにばらつくようですと，ピペットマンのエアリークを疑いますが，その点大丈夫でしょうか？． ピペットマンの手入れは大事ですよ．

(無題) 削除/引用 No.638-10 - 2008/02/12 (火) 09:46:25 - K24 遅くなりましたが、トピ主です。。。 私はBioradの機械でBioradの試薬とABIの試薬を使っていました。 ABIだと蛍光強度が強い、価格が安いとう点に加えて、ばらつきがないときでは、Bioradと同じような結果を出していましたので、問題なく使っていました。 ROXの補正はなく、ブロック式です。 ホットスタートの酵素ですが、機械がホットスタートになっているのか疑問です。 というのも、サンプルを挿入し、Lidを閉じてスタートボタンで開始。開始後、室温から95℃へと上昇しているからです(おそらく約2分程度)。 皆さんのところはどのようにホットスタートになっているのでしょうか？ ピペッティングエラーの可能性もあると思います。ｎ数を増やすという対処もありですが、ターゲットジーンと処理検体が多いので、増やしがたいのです。 あと、フィルターチップを用いていると見た目でもう違う量採取しているときがあるので、それも変えたほうがよさそうです。 私は18SをInternalControlとして使用しています。 前任者と違う結果になってしまうので困ったものです。

Re: 削除/引用 No.638-9 - 2008/02/12 (火) 05:51:49 - AC ＞そめさん ＞すべて腎のサンプルでGAPDHを測定しても 　検体はマウスでしょうか。同一個体のcDNAでのばらつきなら 問題ありですが、違う個体ならさほど問題にならないと思います。 　ただ、もしマウスであるならば、GAPDHは偽遺伝子が200以上あり エクソンを跨いでプライマーをデザインしたつもりでも、増幅される 領域とほぼ100%一致する偽遺伝子がゲノム上にいくらでもある場合が あるので注意が必要です。マウスは、β-actinも同様です。 　同一個体のcDNAでのばらつきなら、やはりピペッティングなどの手技 上の問題の可能性もありますね。例えばcDNAを１反応当たり1μℓ apply といったやり方は避け、最低でも3μℓ applyするなどした方がばらつき を抑えることが出来ます。 　 　後は、ピペットの先端の形状もメーカー毎に微妙に違います。中には ごく微量ピペットに残りやすいのもあり、個人的には、先端に向かって テーパーリングが2段階かかっているものが、使いやすいと思っています。

Hot startですか？ 削除/引用 No.638-8 - 2008/02/11 (月) 19:56:18 - KO 自分も以前はn=2などでやっていたとき、同一サンプルでの ばらつきが大きく、「リアルタイムも使えないな」という印象でした。 Hot startのキットに変えたら、綺麗にそろうようになりました。 PCR mixのメーカーの違いも有るのかもしれませんが、 hot startにしてみると言うのも一つの手かと思います。 ちなみに自分はtakaraのSYBR Greenで検出しています。 （サイクラーもタカラ）

(無題) 削除/引用 No.638-7 - 2008/02/10 (日) 07:27:54 - 7878 ＞そめさん 反応量，加えるテンプレート量はどのくらいかなどの詳細な情報があった方が，具体的な改善方法の提案がしやすいと思いますが。 ＞たとえばすべて腎のサンプルでGAPDHを測定してもCT値が1くらいは幅があります。 これはすべて同じサンプルということなら，確かに信頼性は低いですね。例えばtriplicateでCt値のぶれ幅が１となると，実際の増加量としては上限は2倍で下限は1／2倍なので，CV値は65％になり，とてもじゃないですが信用できません。私なら，「そのままでは定量できない」という回答になります。実際にバラツキが小さければ1.5倍の差でも定量は可能ですし，有意差も出せると思います。 バラツキの原因にまず挙がるのはピペッティングエラーですが，この対策は取られているでしょうか？ また，GAPDHを使われているようですが，この遺伝子は実験条件によっては変動するので気をつけた方がよいです。

(無題) 削除/引用 No.638-6 - 2008/02/09 (土) 19:45:27 - そめ ACさん、情報がすくなく申し訳ありません。 使用機器はABI7000です。試薬はすべてアプライド社のマスターミックス、プライマーなどを使用しております。 たとえばすべて腎のサンプルでGAPDHを測定してもCT値が1くらいは幅があります。このようにGAPDHにばらつきがある状態で、各群で1．5倍くらいのｍRNA量増加量くらいのものをきちんと測定できるのかという内容の質問でした。これでもわかりにくければすいません

(無題) 削除/引用 No.638-5 - 2008/02/09 (土) 01:53:17 - B ロシュのLightcyclerの話ですがケチらずに試薬の量を減らさないことと 純製品を使うことが再現性のあるデータを得る肝だったと聞いたことが あります。

Re: 削除/引用 No.638-4 - 2008/02/08 (金) 02:00:54 - AC ちょっと情報が足りないと思います。crisさんが書かれているような情報を最低限与えないと、助言しようにも…。 「n=2のサンプル」とか「N=３」とかいうのは、いわゆるduplication, triplicationということですか？それでCT値が１程度の幅を持ってばらつくというのは確かに心もとないですね。　詳しい状況を教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.638-3 - 2008/02/07 (木) 23:20:01 - そめ 便乗して質問なので申し訳ないです。 私もリアルタイムのばらつきで悩んでいます。私はGAPDHとの比較で行っています。そもそもコントロールと測定検体のｍRNA比が1．5倍〜2倍くらいの差しかないようなものではきれいに優位さを出せるものなのでしょうか？ コントロールのGAPDHでもN=３でおこなってもCT値が０．５〜１くらいは普通にでます。それだけで1.5倍くらいの差であればどうにでもなるような気がするのですがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.638-2 - 2008/02/07 (木) 09:05:41 - cris リアルタイム用の機種は何を使用されていますか？ ローター式、ブロック式、ROX補正あり無しなどで、ばらつきに対する対策、対応が変わってきます。使用機種を明記された方がレスがつきやすいと思いますよ。

Real-time PCRのばらつき 削除/引用 No.638-1 - 2008/02/07 (木) 06:37:50 - K24 Real-time PCRをここ1年やっていますが、ばらつきが全く改善されません。 まれにきれいにn=2のサンプル(同じcDNA)がそろうのですが、ほとんどがばらついたデータで信頼性がありません。 皆さんはどのようにして、再現性、サンプルのばらつきを調整されていますか？ 教えてください。

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