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(無題) 削除/引用 No.635-16 - 2008/03/02 (日) 01:37:15 - とも 返事が遅れました。すいません。 ＞8410さん サンドイッチの場合は全く対処が異なるんですが 固相化抗体の濃度が濃すぎるとhookし易くなるようです。 もしこれが原因だった場合、単純に固相化抗体を薄くすれば良いのですが、 発色自体が薄くなる可能性があります。 その場合、標識抗体を濃くすれば解決する場合もあります。 アルカリホスファターゼの標識を用いると酵素反応の時間を延長しやすいので便利です。もし余裕があれば、基質にKPL社のbluephos等を用いれば、長時間反応によるブランクの発色も抑えられて良いかと思います。 ただ、先にも申しましたとおり、他の条件で左右される部分が大きいので、他にも何かと色々理由はあるように思います。また何かあれば仰って下さい。。 ＞ほんちゃんさん ハプテンが極端に小さく、しかもポリクロ（protein G精製）だった場合、logit変換に適うようなきれいな逆シグモイドを得るのはなかなか難しいと思います。ベンゼン環やアミノ基などの特徴的な官能基がなければ尚更です。 私も分子量200〜400程度でいくつか系を構築していますが、proteinG精製を経て入手したポリクロは固相化抗原への結合は強いのですが、遊離抗原に対する結合性が低すぎて、きれいな逆シグモイドを描かない場合が多いです。この場合の対処法も様々あります。 さて、0.1ppbですと発色が低かったということですが、固相化抗原と抗体の濃度を上げて一度お試しいただけるといいかと思います。もし、これらの濃度が非常に高くなる、もしくは両者の濃度比が極端にずれるようなら標識後退の希釈倍率を下げてみてお試しください。 実際私はsigmaのALP標識抗体を用いていますが、推奨希釈倍率よりはるかに高濃度の、2000倍希釈で用いています。 様々検討を重ねられるとよいと思います。 また何か御座いましたらご遠慮なく仰って下さい。

hook effect 削除/引用 No.635-15 - 2008/02/23 (土) 13:54:50 - 8410 hook effectたまにありますよねぇ。 競合でない普通のサンドイッチELISAでもあって困ります。 こうした場合の対処法の選択肢ってどういうものが有るのでしょう？ 原因が検討つかないのでどうしたものか、、、。

返答 削除/引用 No.635-14 - 2008/02/21 (木) 14:47:12 - ほんちゃん APさん ありがとうございます。対象物質は無色ですが 今後、有色の物質を扱うことがあればぜひ参考にしたいと思います。 ともさん そのような現象がやはり存在するんですね。 オーダーを1つ下げて実施してみようと思いますが 今の条件では0.0001ppmでも発色が弱くなるので測定が出来ません。 使っている抗体はポリクロです。しかし、ハプテンの分子量が かなり小さいためか、感度が悪いんです。 条件を少しいじってみようと思います。ありがとうございます！

今更ですが 削除/引用 No.635-13 - 2008/02/18 (月) 21:12:56 - とも いくつか間接競合ELISAの系を確立してきた者です。 少しでもお役に立てればと思います。 いわゆる「low dose hook effect」が見られるということでしょうか？ qqさんのお答と少しかぶるんですが、 濃度を0.001ppmよりも下げて測定を行ってみて、 測定結果が、上に凸のカーブを描けば ほぼ間違いなくhook effectだと思います。 私が実験を行ってきた過程でも、いくつかそのような現象 （最も吸光値が高くなるはずのブランクよりも、測定対象を低濃度で加えた場合の吸光値がより高くなる） が見られました。 私の場合は、 １　固相化抗原―抗体の濃度比 ２　固相化抗原のハプテン密度 のどちらかを変化させた場合、hook effectは解消し、 感度も1オーダー程上がりました。 数は少ないですが、文献でも同様の傾向が報告されています。 以上です。 見当違いでしたらすいません。 散々書いておいてこう言うのもあれなんですが、 競合に用いる抗体がポリクロかモノクロかによっても 結果や対処法は随分違います。 筆足らずな部分があれば仰って下さい。

(無題) 削除/引用 No.635-12 - 2008/02/18 (月) 18:08:19 - AP 予備実験ですでに影響がないことを確認されているかもしれませんが、 ・競合物質自体に、測定波長の吸光性がある。 ・競合物質自体に発色を促す作用がある（酸化剤性など）。 もしそれが原因だとしたら、 どのような実験系なのかはわかりませんが、競合物質が特異的抗体であるならば、希釈を過剰量の正常血清や免疫グロブリンでおこない、とうぜんBlankはそれから特異抗体のみを抜いたものにすれば、競合物質自体の濃度変化による吸光度への影響を排除できると思います。 または、測定波長に対する競合物質自体の吸光係数を求めておいて、競合物質の入ったサンプルの測定値からは、その量に相当する吸光度を差し引くとか。

返答 削除/引用 No.635-11 - 2008/02/18 (月) 16:55:47 - ほんちゃん ぬぬぬ？さん はい、発色は室温で行っています。発色基質は常温に戻してから使用していますが何か問題がありそうでしょうか？ ブランクと0.001ppmのウェル位置は 未使用ウェル 上　10ppm ↓　1ppm ↓　0.1ppm ↓　0.01ppm ↓　0.001ppm 下　ブランク 未使用ウェル で行っています。 「位置関係」の説明は上記の解釈であっているでしょうか？？ 発色する際、室温が低いことはあります。暖房などつけていないと20度以下です。

(無題) 削除/引用 No.635-10 - 2008/02/17 (日) 19:18:50 - ぬぬぬ？ すごく基本的な確認ですけど，発色用の基質は室温で使用してますよね？ 仮に室温ではない場合，0.001ppmとブランクのウェルの位置関係はどのようになっていますか？ 基質温度が室温ではない場合，ウェルの位置関係によっては多少ぶれが出ます．

返答 削除/引用 No.635-9 - 2008/02/17 (日) 18:06:40 - ほんちゃん ｑｑさん 全くその通りなんです・・。

(無題) 削除/引用 No.635-8 - 2008/02/15 (金) 22:19:42 - qq 「blankがblankになっていない」としか思えませんが．．．

返答 削除/引用 No.635-7 - 2008/02/15 (金) 17:36:28 - ほんちゃん qqさん それを指導教授にもいわれました！ ブランクとそれ以外の操作は何も変えていないのですが やはり今日も0.001よりブランクの方が発色が弱かったです。 まったくもって原因がわからず途方にくれています。 ちなみに今日は通常どおりPBS‐Tweenでおこないました。

(無題) 削除/引用 No.635-6 - 2008/02/14 (木) 23:35:30 - qq ちょっと意地悪で、もしかすると解決があるかもしれない質問です。 0.001ppmがblankよりも、値が大きいとして、0.00001ppmまで伸ばすとどうなるのでしょうか？ 0.00001ppmとblankには操作上に違いがあるのでしょうか？ 無限希釈はblankと同等だとして悪いのだとすると、そこに回答があるように思えます。

返答 削除/引用 No.635-5 - 2008/02/14 (木) 16:30:38 - ほんちゃん トリス緩衝液を使ってELISAをしたことがありません。 今までPBSを使っていたので ぜひ参考にしたいと思います！ トリス緩衝液も一般的に使用されているので PBSにとらわれずに実験してみます。 アドバイスありがとうございました。 いい実験結果がでるよう努力したいです。

(無題) 削除/引用 No.635-4 - 2008/02/14 (木) 16:16:36 - K あぁ、なるほど…濃度は競合物質のものですか こちらの理解力不足でした。 blankへのコンタミが無いとすれば、Phosphateが影響を与えてませんか？ Trisの系に変えるとどうでしょうか？

返答 削除/引用 No.635-3 - 2008/02/13 (水) 16:37:49 - ほんちゃん Kさん アドバイスありがとうございます。 言葉足らずだったのですが、間接競合ELISAなので10ppmがもっとも薄く〜0ppmが通常もっとも濃く発色します（すると思います）。 本実験ではブランクの発色が0.001ppmよりも薄く発色してしまうためLogit変換ができないのです・・・。

(無題) 削除/引用 No.635-2 - 2008/02/08 (金) 16:44:37 - K blankは理論上発色しないので、値は０になるはずです。 blankの値が0.001ppmの値よりも小さい値ならば、実験は正しく行われたのではないでしょうか？ そもそも、計算式は log_10 ([Absorbance_X ppm])-log_10 ([Abosorbance_blank]) ではなく log_10 ([Absorbance_X ppm]-[Abosorbance_blank]) だと思うのですが、いかがでしょうか？

ELISAのブランク低発色について 削除/引用 No.635-1 - 2008/02/06 (水) 21:17:35 - ほんちゃん 競合ELISAの最適条件を探しています。10ppm〜0.001ppmまでの競合反応はきれいに出る条件を見つけました。 しかし、ブランク（0ppm）での発色が0.001ppmよりも低く、Logit変換ができません。 このようにブランクで発色が低くなる理由はなんでしょうか？ バッファーはPBS−Tweenを使用し 標品の希釈などに有機溶媒は一切用いていません。 何かご存知でしたら参考にさせて頂きたいです。 よろしくお願いします。

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