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(無題) 削除/引用 No.633-6 - 2008/02/09 (土) 01:37:22 - trans お返事ありがとうございます。 細胞集団で実験していくのは難しそうですね。 こつこつとシングルコロニーを分離してやっていきます。。

(無題) 削除/引用 No.633-5 - 2008/02/06 (水) 13:11:17 - KO trans様、ご参考までに。 > KO様が以前行った実験はプラスミドでの安定発現株作成および細胞集団としての使用だったのでしょうか？実験はうまく行きましたでしょうか？ 　プラスミドとしてではなくレンチウイルスを使ってバルクでやっていましたが、その実験ではphenotypeが見えました。 　おっしゃるようにプラスミドですと、コロニーによって入り方が全く違うのでバルクでshRNAというのは難しいかもしれません。 　 > あと、細胞集団として集めた後に、その細胞集団からシングル細胞として細胞を分離して使用することは可能でしょうか？経験ある人おられますでしょうか？ 同僚がやっていましたので、可能だと思います。 しかし、たとえば発現すると増殖の悪くなるものを入れたりすると、飼っているうちに集団内での割合が減ってしまうので、最初からシングルでできればそのほうがいいかもしれませんね。逆だったら良いかもしれませんが。

難しそうですね。。。 削除/引用 No.633-4 - 2008/02/05 (火) 23:03:35 - trans hito様、KO様 アドバイスありがとうございます。 プラスミドを用いたRNAiで細胞集団としての安定発現株を用いるのは難しいようですね。レンチウイルスですがこちらでは使える設備が無いので候補からはずしています。 KO様が以前行った実験はプラスミドでの安定発現株作成および細胞集団としての使用だったのでしょうか？実験はうまく行きましたでしょうか？ あと、細胞集団として集めた後に、その細胞集団からシングル細胞として細胞を分離して使用することは可能でしょうか？経験ある人おられますでしょうか？

レンチを使ってみては？ 削除/引用 No.633-3 - 2008/02/05 (火) 20:56:56 - KO レンチやレトロウイルスで shRNA発現カセットを入れればバルクでできる可能性があります。 確かにトランスジーンが入った場所によりshRNAの発現が 異なることは考えられます。 そこで高タイターのレンチやレトロで複数コピー細胞に導入することができれば、その効果は考えにくくなります。 shRNAの効きが良いのならそれでできると思います。 自分は一部の実験はその方法でやってました。

う〜ん 削除/引用 No.633-2 - 2008/02/05 (火) 18:35:19 - hito 細胞集団でとると、どうしても発現量の低いものと高いものが混ざってしまうのでおすすめしません。特に免疫染色では、光り方がばらついて見にくいです。 面倒でもクローニングした方がいいと思います。

安定発現株の取り方（RNAi） 削除/引用 No.633-1 - 2008/02/05 (火) 18:20:24 - trans 現在、RNAi配列を発現している安定発現株を取ろうと計画しています。 ホストとして２種類の細胞株を使用し、RNAiベクター（プラスミド）はコントロールも含め４種類使用する予定です。つまり、計８種類の安定発現株を取る予定です。 薬剤セレクション後細胞株をピックアップしてとる場合、１種類につき２０コロニーくらい取るとして、計１６０個の細胞株を取らなくてはいけないことになります。 もし、薬剤セレクション後の細胞を全部まとめてひとまとまりで回収した場合、計８個の細胞集団ですみます。 そこで、皆様にご意見をお伺いしたいのですが、細胞集団（後者）としての実験をされた方おられますでしょうか？また、その際の好都合、不都合な点などお教え願えないでしょうか？ ちなみに、当方の実験は、RNA・タンパクの発現を見る実験と免疫染色を考えています。

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