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プライマーの不具合 削除/引用 No.631-8 - 2008/02/15 (金) 17:28:12 - ICA みなさん プライマーを買い直したら解決しました。プライマーの不精製かコンタミが原因だと思います。 しょうもない理由でした。 　とにかくコメントありがとうございました。参考になりました。

お礼 削除/引用 No.631-7 - 2008/02/06 (水) 01:09:31 - ICA みなさん　助言ありがとうございます。 いくつか試してみてからまた報告させていただきます。 通常のPCRとアガロースゲルでsingle strandが検出できるほど生じることがあるのですね。

(無題) 削除/引用 No.631-6 - 2008/02/05 (火) 21:37:58 - う〜んと Tさんの予想と同じ意見です。 ダイマーなどをインサートしたのなら、300〜500bpが目的産物になるのでこれくらいの長さならシーケンサで全鎖長読めますよね。 確率的に云々のくだりは、最初のPCR産物が600bp以上のサイズが多かったという意味ですよね。 コロニーPCRの条件が悪かったんでしょう。 時々あることです。 悩んでるより、プラスミドとればすっきりしますよ。

多分 削除/引用 No.631-5 - 2008/02/05 (火) 19:33:03 - Ｔ 小さい方のバンドは大きい方のバンドが変性して一本鎖になったものだと思いますよ。 試しにプラスミドをミニプレップしてインサートを切り出してみてください。 大きな方のバンドと同じサイズのフラグメントが切り出されると思います。 変性の原因としては PCR の条件、試薬の pH 異常などが考えられます。

(無題) 削除/引用 No.631-4 - 2008/02/05 (火) 19:28:42 - ~ デリーションしやすい配列を扱っているわけではありませんよね？ 原因としては、 １．入っているベクターが全部おかしくなった ２．コロニーPCRの条件が原因で、おかしい産物が出来ている の２点くらいだと思いますが、１は考えにくいかと思います。 まずは２が原因ではないことを確認するのが始めの１手ではないでしょうか。 コロニーPCRの場合、トランスフォーメーション時に大腸菌に入らなかった多量のDNAが混入して増えることがあると思いますが、 それらを増やしているということはありませんか？ または、PCRのサイクルをまわしすぎて、へんな産物を作っていませんか？ 一度、数クローンをミニプレップして中身を確認されてはいかがでしょうか。 EcoRIで切って、どのクローンも２種類のインサートが入っているのでしたら、私ならば次の手段としてそれぞれをシークエンスします。 2本のバンドをそれぞれつんつんPCR http://www.biology.tohoku.ac.jp/lab-www/cellbiol/kojinn/oba/1cell.html で増やしてシングルバンドにしたら、何が増えているのか読めると思います。 ミニプレップが面倒であれば、コロニーを拾って別のプレートでレプリカを作製し、そちらからコロニーPCRをすることでトランスフォーメーションに用いたDNAの混入量を減らすことが出来ます。 ただ、PCRの条件が原因（サイクル数のまわしすぎなど）が原因であれば、こちらの方法では確認できません。

(無題) 削除/引用 No.631-3 - 2008/02/05 (火) 18:35:08 - ICA 制限酵素での切断はしていないです。コロニーを液体培養してプラスミドを精製する必要があるでしょうか。 phosphataseなどの処理は，PCR反応液中のプライマーがA-tailing中に使われることを心配しました。 インサートは全部は読んでいません。読めた一部の範囲ではそのような感触はありませんでした。 私もダイマーがライゲーションされたことを疑っていますが，すべてのコロニーで2本バンド間の長さの比が一定（おおよそ2）になるのかわかりません。ライゲーションに用いたPCRプロダクトは無数の異なる断片長の混合物ですから、長さが等しいPCRプロダクトよりも長さの異なるPCRプロダクトがダイマーを作る確率の方が高いように思います。

(無題) 削除/引用 No.631-2 - 2008/02/05 (火) 16:05:45 - TA-cloning 幾つかお聞きしたいのですが、 ＞その後コロニーPCRをしたところ、必ず2本のバンドが現れ、大きい方のバンドは常に小さい方のバンドの2倍の差があります（アガロースでの大まかな推定）。 ユニークな制限酵素で切っても同様の結果ですか？ ＞もとのPCRプロダクトはalkaline phosphataseとexonucleaseで処理し， 必要無いと思いますが、、、なんで？ ＞コロニーPCR後に強引にシーケンスをしてみると汚いながらそれらしい配列が出てくるので，目的のDNA断片がインサートされているようです。 全部読んだらインサートのダイマーではなかった？

コロニーPCRでサイズ2倍差の2本バンド 削除/引用 No.631-1 - 2008/02/05 (火) 11:37:56 - ICA バンドが無数に出るPCRプロダクトの各フラグメントを精製することを目的に大腸菌でサブクローニングをしました。その後コロニーPCRをしたところ、必ず2本のバンドが現れ、大きい方のバンドは常に小さい方のバンドの2倍の差があります（アガロースでの大まかな推定）。 　もとのPCRプロダクトを作ったときのプライマーを使っても，M13プライマーを使っても結果は同じです。大きいバンドの方が小さなバンドよりも常に良く増幅されており，M13を使ったときの方がその濃度差は大きくなります。 　バンドは，300bp-1000bp程度の大きさです。大きな方，小さな方どちらも目的のDNA断片の可能性がありますが，確率的には大きな方であることが多いはずです。大きな方は，600-1000bpくらいです。 　いったい何が起きているのでしょうか。また，解決法についても教えていただければ幸いです。 　pGem T-easy vector, J109を使っています。もとのPCRプロダクトはalkaline phosphataseとexonucleaseで処理し，ライゲーション前にA-tailingの目的でTaq polymeraseで30分処理しています。 　コロニーPCR後に強引にシーケンスをしてみると汚いながらそれらしい配列が出てくるので，目的のDNA断片がインサートされているようです。

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