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ありがとうございます。 削除/引用 No.628-5 - 2008/02/06 (水) 14:27:56 - kuma もよよ様 とも様 BBB様 ご返信ありがとうございました。 大変勉強になりました。 その後、低温発現誘導を行ったところ、 多少発現が増えた手応えです。 反応系を大きく＆低温で一度精製してみたいと思います。 また、頂いたアドバイスを出来るところから、 実験しようと思います。 ありがとうございました。 くま

(無題) 削除/引用 No.628-4 - 2008/02/05 (火) 21:14:59 - BBB GSTは３量体をつくり、GFPも多量体化（４量体）を 作ると聞いたことがあります。 GST融合タンパク質として発現させた場合、多量体化して溶解度が下がり、 アグって封入体を作っているのかもしれません。 　His-tagなどでやってみるのは一つの手だと思います。 　低温誘導は、IPTG1mM１８℃１２時間IPTG1mMでやってます。 　pColdベクターを使ってみるのも良いかもしれません。GSTよりかなり大きくなってしまいますが。 　リフォールディングは、必ずこの条件でうまくいくという条件は無いと思います。０．４Mのアルギニンを加えるとリフォールディングの効率があがるとか、グルタミン酸とアルギニンを入れるとタンパク質の溶解度が上がるとか色々ノウハウはあるらしいです。

(無題) 削除/引用 No.628-3 - 2008/02/05 (火) 09:31:15 - とも 最近はタカラとかでシャペロンが入った大腸菌なんかも売っているので試してみるのはどうですか？？あと４度で増やす大腸菌なんかもありますよ。 細胞にかけるときはデタージェントを完全に除かないと死にますよ。 あと塩濃度などの調整も大事です。 最終的にはPBSかカルチャーメディウムで溶かしてくださいね！

(無題) 削除/引用 No.628-2 - 2008/02/05 (火) 09:28:05 - もよよ 封入体を作っている？のかどうかきちんと確認されていないのであれば まずは封入体を作っているのか、単に発現していないのかを 確認する方が先だと思いますが。 1)タンパク質に依る。 私個人的には、低温培養で可溶化したタンパク質の割合が 増えることがある、という感じ。 それでもやらないよりはやってみた方が良い。 まれに劇的に変わる事がある模様。 2)ないです。上手くいく方が少ない。 サイズが100kDaと比較的大きいので、もし同じタンパク質を リフォールディングしている文献があったとしても 一回での再現は難しいのでは。 それで溶けたからといって正しく折り畳まれたとは限らない。 そういえば、高濃度アルギニンで溶かすというのもあります。 次の実験に影響無ければ溶けるかどうかやってみても良いでしょうが、 細胞相手では無理かな。 個人的には、可溶化したタンパク質を使いたいのであれば、 大腸菌系発現系でダメなら早々に別の系に変える方をお勧めします。 大腸菌系でちょっとでも可溶化しているのであれば スケールをあげて対応するとか。 なお、大腸菌系の場合、低温培養の他に IPTGの量を下げる（0.1mM程度でも誘導されることがある） 誘導培養時間を減らす（30分とか） エアレーションを調整する 大腸菌株を変える（origamiとかrosetta-gamiとか） なども考えられます。 他に私の知らないのもあるかもしれませんが、ご参考に。

蛋白質精製について 削除/引用 No.628-1 - 2008/02/04 (月) 21:15:59 - kuma 初めて組み換え蛋白質精製(GST-tag)を行っております。 プラスミド：pGEX-6P-2 発現：大腸菌BL21(DE3) 使用目的：細胞へのインジェクション EGFP付加目的蛋白質（約100kDa）をpGEX-6P-2に挿入しました。 IPTGで発現誘導し、大腸菌に蛍光蛋白発現を確認出来てます。 また、発現誘導条件はpGEX-6P-2に蛍光蛋白質のみ挿入したプラスミドも作製しました(pGEX-6P-EGFP)。 しかし、単に蛍光蛋白質のみを発現させた時と比較し、 EGFP付加目的蛋白質の発現量が相当低下してしまいました。 なんとか精製し、蛍光観察で確認できるものの、 SDS-PAGEで検出不可能なほどの発現量です。 しかも細胞へ精製蛋白質をインジェクションした時、 細胞内でダマになっているものが観察されました。 色々な参考書等を読んだ限り、 封入体を作っている？と言う結論に至りました。 低温発現誘導等、まだ試行錯誤が必要だと思っておりますが、 全く未経験な部分なもので初歩的な質問をさせて頂きたく存じます。 １）封入体は低温培養によって、大抵の場合回避できるものなのでしょうか？ ２）リフォールディング方法は、大抵の場合はこれで行ける！という条件があるものなのでしょうか？それとも細かく最適条件を探す必要があるものなのでしょうか？ どうぞよろしくお願い致します。

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