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(無題) 削除/引用 No.624-5 - 2008/02/05 (火) 00:03:13 - C ありがとうございました。 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.624-4 - 2008/02/04 (月) 19:24:06 - ats タンパク質など三次元の構造を取るものが抗原の場合、アミノ酸配列的には離れていても三次元構造的には近い部位を認識したり、（二次元的な）ル−プ的な構造部分を認識する抗体があるからです。 これらの構造は、SDS-PAGEで破壊されるので、抗体が結合できなくなります。 抗体の抗原認識部位は、デコボコした（どちらかというと）平面的な領域、溝、穴のような形状があり、抗原によってどの形状を（優先的に）使用しているか、言い換えれば抗原との結合に関与する部分が変わります。 ポリクロ−ナル抗体はいろいろな抗体の混合物なので、高次構造を認識する抗体、連続したアミノ酸配列（高次構造をとるもの、取らないもの）を認識する抗体が混ざっていると言えます。 ただし、ペプチドを免疫したポリクロ−ナル抗体（抗ペプチド抗体）は、そのペプチドの（高次）構造が天然タンパクと異なる場合、western blotには使えますが、免疫染色に使えないことは良くあります（涙）。抗ペプチド抗体を作製したとき、抗原として使用したペプチドにはELISAで良好な反応性を示すのに、western blotにも免疫染色にも使えなかったことも１回ですがありました（涙涙）。個の原因は不明です。合成ペプチドの取り違えかどうかの結論も出ず封印しました。このようなときは、ペプチドのデザインが悪かったと諦めるしかないですね。だから、いろいろな本では、最低2ヶ所、可能なら３〜４のペプチドをデザインして免疫しましょうと書いてあります。2〜3ヶ月程無駄になりますから。

(無題) 削除/引用 No.624-3 - 2008/02/04 (月) 17:28:10 - C すごく初歩的な質問かもしれませんが、なぜモノクローナル抗体だと免疫染色には使えてウエスタンブロッティングには使えないような抗体ができてしまう場合があるのですか??

(無題) 削除/引用 No.624-2 - 2008/02/04 (月) 14:24:05 - ats モノクロ−ナル抗体の場合、免疫染色可能な（Nativeなコンフォメ−ションの抗原に結合できる）性質とウエスタンブロッティング可能な（denatureした抗原に結合できる）性質を両方兼ね備えているとは限りません。両方持っている方が使い勝手は良いのですが。 抗原のcDNAがあれば、強制発現細胞と無処理細胞を用いたELISA、および組織染色・免疫沈殿(IP)等で、特異的免疫染色可能な抗体の選抜が可能です。cDNAがない場合は、非発現組織が判明していれば良いですが、それすら不明な場合、IPで特異性を調べるしかないかも。 どちらの性質を重視したmAbを単離するか決めて、運がよければ両方使えると考えて、スクリ−ニングしないと中途半端な（結合が弱いとか特異性が低い）抗体を選抜する可能性がありますので注意してください。

ウエスタンブロッティング 削除/引用 No.624-1 - 2008/02/04 (月) 13:56:28 - C あるタンパク質に対する抗体をマウスで作製し、ハイブリドーマの培養上清を用いて免疫染色やウエスタンブロッティングを行っています。 そこで現在困っていることがあります。 ある組織の免疫染色（パラフィン切片）ではきれいに染色されるのに、その組織での発現をウエスタンブロッティングによって検出しようと試みたところ、目的の位置にバンドが出ず、複数のバンドがうっすら検出されるだけなのです。タンパク量も出来る限り流したのですが結果は同じです･･･ 原因が分からず悩んでいます。 どなたか何かアドバイスをいただけないでしょうか??

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