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(無題) 削除/引用 No.619-5 - 2008/02/04 (月) 18:42:47 - み カナマイシン様 アドバイスを頂きありがとうございました． 再度，RNA抽出を行い，吸光度測定時の希釈に10mM Tris-HClを使用しましたところ，純度が約1.95と申し分ない結果となりました． また，収量も組織17mgから54μg得られ，若干少ないではありますが，今後の実験に移れそうです． 純度の件に関しまして解決済みと致しますが，収量に関してアドバイス等がありましたらどんどんお願いします．

(無題) 削除/引用 No.619-4 - 2008/02/04 (月) 10:30:14 - カナマイシン 水で希釈して1.5-1.7ならかなり純度がいいと思います。 半定量RT-PCRには十分なんじゃないですかね。 しかしどちらにしろ吸光度のみで純度判断は危険な気がします。 最低でも泳動してrRNAのチェック、 できればバイオアナライザでチェックできると最高ですね。

うかつでした．．． 削除/引用 No.619-3 - 2008/02/03 (日) 21:32:29 - み パンタ様．レスを頂きありがとうございます． 仰るように希釈にトリスを使用していませんでした． ハンドブックを確認したところ，10mM Tri-HCl (pH7.0)を使用することとありました． 早速，バッファーを調製し，測り直してみます． また，その他にお気づきのことありましたら，どんどんご指摘下さい． よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.619-2 - 2008/02/03 (日) 19:48:00 - パンタ 以前にも出たと思いますが、純度を測る場合は希釈時に10mM Tris-HCl, pH7.5を用いるとよいらしいです。 RNeasy mini handbook（3rd edition)の91ページに書いてあります。 もしかしたらこれで行ってらっしゃるかもしれませんが。

RNA抽出時の純度を上げたい！ 削除/引用 No.619-1 - 2008/02/03 (日) 17:04:11 - み この度，初めてRNAを取り扱う事になりました． サンプルはラット肝臓で，抽出にはキアゲン社のRNeasy Mini Kitを使用しています．目的はRT-PCRで半定量を行う事です． 実際に自分で操作してみると，色々と手間取る事がありましたが，どうにか収量を上げる事はできました．しかし，純度が1.7〜1.5と低く，どうした物かと悩んでいます． 手順としては， �@組織約15mgにRLTを0.6ml加え，ペッスルでホモゲナイズし，26G付シリンジで10回程度吸い出し �A13,000rpmで遠心（室温） �B上清を分取し，等量50%EtOHを添加後，混和 �C以下，遠心条件を13,000rpmとした以外はプロトコール通りに操作 �DRNAの溶出はトータル0.1mlのnuclease free water（イラストレイテッドを参考にしました） �E100倍希釈溶液で260,280nmを測定 RNAの収量は約47μg程です．少ないと思われますが，色々やってみてこの程度です． 操作の不手際などあるかと思いますが，ご指摘やアドバイスを頂ければ幸いです．よろしくお願いします．

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