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(無題) 削除/引用 No.610-8 - 2008/02/06 (水) 19:08:43 - a 対数増殖期からですと、蛋白質・RNA合成も盛ですし、染色体複製も行われているため、プラスミドのコピー数当たりで考えるとゴミが多くなります。 ただ、綺麗にこれらを除けば純度は同じかもしれません。まあ、制限酵素処理などには少々汚くても問題ありませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.610-7 - 2008/02/05 (火) 14:12:12 - 奴隷 7、11 kbに見えるものが、それぞれ閉環状、開環状分子で、5 kbのものは変性してしまった分子ということはないでしょうか。ゲルの堅さにもよりますが、7 kbのプラスミドであれば閉環状分子は7 kb程度に泳動される気がします。 また、その場合、菌体量が少ないときに限り5 kbのバンドが出ているのは、アルカリ変性がキツ過ぎて変性してしまっているという解釈です。 shRNA発現用プラスミドだとリピート配列があるので変性しやすいのかも知れません。

根拠 削除/引用 No.610-6 - 2008/02/05 (火) 14:04:21 - プラスミド みなさん、ご返答ありがとうございます。 使用しているキットは、アマシャムのFlexiprepという製品です。スピンカラムタイプではないですが、原理はQiagenのキットと同じだと思います。 ニックが入っている、という表現をし続けていますが、アガロースゲル電気泳動で見えるバンドの位置で確認しているだけです。当該プラスミドDNAのサイズは7kbでして、閉環状、直鎖状、開環状（と考えている）のものが5,7,11 kbのあたりにでています。対数増殖期のものでは、5と7kbが見えていて（ほとんどが5kb)、O/Nカルチャーでは、7と11kbに出ています（ただし、たまたま菌数が薄かったものは5,7kbに出ました）。いずれのプラスミドも、制限酵素でワンカットすると7kbのみにでます。こういうわけで、長めに培養したときにのみ、カルチャー時にニックが入っているらしいと考えました。このように考えるのは適当ではないのでしょうか？ shRAN vector用の大腸菌というのは持っていません。そう言うのがあるとは、知識不足で知りませんでした。ヘアピンのような特殊な二重構造が入るプラスミドを増幅するのに適しているのでしょうか？今までは、普通のDH5aで問題なかったんですが。

(無題) 削除/引用 No.610-5 - 2008/02/05 (火) 12:31:44 - ~ 制限酵素で1cutしてみたりの確認はもうしていますよね？ 開環状の時と直鎖状のときの2パターンがあるのですか？ 直鎖状ならば、ユニークな部位で切れるのならば2cut、ランダムに切れているのであれば、スメア状になると思いますが、どちらでしたか？ siRNA発現用のベクターを増やそうとしているということは、 ヘアピン構造を持つベクター用のコンピテントセル(StblシリーズやSUREなど)もお持ちですよね？ 大腸菌株が原因だと考えているのであれば、 そちらで増やしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.610-4 - 2008/02/05 (火) 11:11:49 - 奴隷 ご覧になっているゲル上のバンドが直鎖状、開環状のプラスミドだと判断されている理由は何でしょうか？ 切断やニックがsolution �Uを加える前に起こっているとしたら、solution �Vを加えても元の形にはrenatureできないはずなので、上清に来るとは（キットで精製できるとは）思われません。切断やニッキングが起こっているのはそれ以降のステップであるはずです。プラスミドを最終的にTEに溶解しているなら、その状態で持ち込みの痕跡量ヌクレアーゼが効くというのも不思議です。 お使いのキットは何でしょうか。

とりあえずとれました。 削除/引用 No.610-3 - 2008/02/05 (火) 00:35:00 - プラスミド aさん、ご返答ありがとうございます。 調製はキットを使ってます。いくつかのクローンをミニプレップしたときに、収量の低いクローンは、ニックが入っていないという現状ですので、キットは大丈夫だと思っています。 おっしゃられるとおり、対数増殖期の培養液からだと収量はかなり低くなりましたが、ゲルで確認したところ、ニックが入っていない物が取れていましたので、OKにしようかと思っています。量が必要なときは、スケールアップで対処しようと思います。 一つ教えてもらいたいのですが、対数増殖期からだと純度がいまいち、というのはどういうことなのでしょうか？ゲルで確認したところ、ほとんどが閉環型でしたので、大丈夫だと思っているのですが、ここでおっしゃっている「純度」とはどういうことなのでしょうか？ 教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.610-2 - 2008/02/01 (金) 19:15:13 - a plasmidの調製はkitですか？自家製ですか？ アルカリ法の場合、アルカリ処理が長すぎるとニック入ります。 自家製なら、Sol.IIIのpHをチェックしてみては如何でしょう？ 100種類以上はplasmid取っていると思いますが、5ccで18時間培養(37℃)したカルチャーから問題なく取れています（JM109も含め）。 対数増殖期からだと、収量は少ないですし、純度もいまいちかなあと思っています。

プラスミドにニックが入る 削除/引用 No.610-1 - 2008/02/01 (金) 13:30:51 - プラスミド いつも勉強させてもらっています。大腸菌を用いたプラスミドの増幅と精製についての質問です。 現在、JM109株を用いて、pRNAT-U6.3/hygというプラスミドの増幅を行っています。しかしながら、精製後、アガロースゲルを流すと、閉環状のプラスミドがとれず、ほとんどが直鎖状、開環状のものになってしまいます。何度か試したところ、収率が悪いときは閉環状のものがとれ、収率が良いときには取れないようです。おそらく今回の場合、大腸菌がある一定濃度以上増えると、ニックが入りはじめるような印象を受けるのですが、過度の培養はしておりませんし、少々疑問に思っています。 これまで、様々なプラスミドを増幅してきましたが、今回と同じ培養条件で閉環状の物がきちんと取れてきていました。ただし、今回と違うのは、いままではDH5aやXL10を使っていたことです（ラボが変わったため、今回はJM109を使用）。 プラスミドと大腸菌株の組み合わせにより、このような現象が起きているのかと推察しているのですが、一般的によく起きることなのでしょうか？ 対応策としては、早めに培養を切り上げることで解決はできると思うのですが、温度を下げて培養してみる（増殖速度を下げる）というのも効果的だと考えられるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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