こんばんは。
皆様のお知恵をお借りできればと思い、質問させていただきます。
長文になりますが、よろしくお願いします。
まず、ある遺伝子Xのアイソフォーム特異的shRNAベクターが欲しいというのが
実験の目的です。
Xは異なる別のプロモーターからN末端のないDNというアイソフォームを持ちます。Xにはexon2,3が含まれますが、DN-Xは異なるプロモーターのためexon3'を持ちますが、これが３０ｂｐと極めて短いため、DN-X特異的
shRNAベクターをデザインしたときに、5'UTRにしかターゲットがうまく見つかりませんでした。（exon4以降は共通）当然Xはexon2,3がターゲットなので、簡単にデザインすることができました。
さて、このshRNAが効くかどうかチェックするときに、retro virus を作って、ターゲットの幹細胞に感染させてreal timePCRでチェックすることも考えたのですが、発現が低いのと感染効率の問題がある可能性があって、より簡便に２９３細胞に5'UTR+cDNAを過剰発現させて、同時にshRNA vectorもトランスフェクトして、それでウェスタンで確認すればいいと考えました。
そこで、５’UTR（３００ｂｐ）をクローニングして、pcDNA3.1(+)に
CMVpromoter+5'UTR+cDNA of DN-Xというコンストラクトを作って、
過剰発現してみましたが、ウェスタンで蛋白発現を確認できませんでした。
（non scramble+DN-X)
当然、コントロールとして、DN-X onlyのトランスフェクションが必要だったのですが、今回はしていません。
１，ベクターのシークエンスは正しいです。向きも正しいです。kozak sequence も当然genomeのままです。
２，トランスフェクションはshRNA vectorにGFPがついているので、されていることが分かっています。（ダブルトランスフェクション）
３，一次抗体も同時にXの実験も行ったので、死んでいないことが確認できています。
４，蛋白はきれいに転写されています。二次抗体もECLもXの方ではうまくいっているので、生きています。
このことから、5'UTR＋ｃDNAというデザイン自体の問題を疑っています。
ですが、もし蛋白が翻訳されなくても、real timeでRNAをチェックすることもできるので、こちらに進もうかいま考えているところです。
質問のポイントは、
１，このベクターの構造に問題がある可能性が高いのか？
２，real timeに進むべきか？
３，見落としは？
以上です。
長文失礼しました。
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