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これからまたがんばってみます 削除/引用 No.606-8 - 2008/02/07 (木) 15:12:19 - むすくる 周囲の知人にも相談しましたが、彼らからもやはりタンパク質によっては細胞から量があまり稼げなくてもしょうがないという話をされました。スケールアップか別の手段を取る他ないと意志が固まりました。皆様に指摘していただいた御蔭です。またがんばってみます。 どうもありがとうございました。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.606-7 - 2008/02/01 (金) 20:10:06 - むすくる 確かにコントロールを作れば、スケールアップの見積もりができますが、コントロールを作るもかなり大変そうですね。 論文等で調べているところ、似たような実験では（内在性タンパクを見ている場合ですが）10の10乗cellを用意した、などと書いてありました。やはり１００枚単位での実験なのだな、と認識を改めてます。今のディッシュ数枚の条件では見えてこなくてしょうがないのかもしれません。まったく認識が甘くてお恥ずかしいです。

(無題) 削除/引用 No.606-6 - 2008/02/01 (金) 03:09:58 - コントロール 面倒ですがCBBで見えるFLAGタグーコントロール蛋白のコントロールをとります。FLAGタグーコントロールとのウエスタンの比でスケールアップの程度が計算できます。

(無題) 削除/引用 No.606-5 - 2008/02/01 (金) 02:27:07 - C ここで紹介されている銀染色のキットを使うと切り出したゲルを 脱色してマススペクトルの測定に使えるようですね。 http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/proteomics/pdf/S-414_Proteomics_and_ProteinExpression_128-138.pdf

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.606-4 - 2008/01/31 (木) 19:13:51 - むすくる 燐太郎さま、Aさま、お返事ありがとうございました。 FLAGタグを付加したタンパク質を培養細胞で一過的に発現させ、免疫沈降法で精製したところSyproRubyで見えるほどには精製できなかった。そういうことがあるのか？ということを尋ねたわけですが、目的タンパク質の性質によっていて、よくあることだ、ということですね。 僕も燐太郎さんが言われた通り、スケールアップを考えているのですが、現時点であまりに少ない(SyproRuby検出限界以下）とCBBレベルにもっていくにはいったいどれくらいスケールアップがいるのか・・・、現実的な量でないのなら（例えばディッシュ1000枚とか）、別の方法論に変えなくてはならないのかなぁ、と思って質問させてもらった次第です。 まずはAさんの言う通り、銀染してみようと思います。メンブレンから抽出してマスをおこなうというのは僕もプロトコル本で読んだことがあります。業者と相談してみたいと思います。 スケールアップする場合というのは、例えばディッシュを100枚用意してライセートを作り、それを少量のFLAG-agaroseを詰めたカラムに通して、少量のelution bufferで溶出する、というイメージでよいのでしょうか？すみません、素人質問で。

(無題) 削除/引用 No.606-3 - 2008/01/31 (木) 18:33:27 - A SyproRubyの感度がどれぐらいかわかりませんがもしサンプルがあるのなら 一度確認のため並行して銀染色もされてはどうですか？基本的に銀染色の バンドは定量的でないはずですが（これは主に蛋白質の糖付加の影響を 受けるからといわれています）同じ蛋白質同士であればある相対的な 定量性はあるでしょうから実際に検出できないのがサンプル量の問題なのか SyproRubyの感度の問題なのかは切り分けられるはずです。あとマス スペクトルですがサンプルをゲルから抽出してプロテアーゼ処理して 測定するということですか？業者ではなく論文での話ですが目的の蛋白質 をメンブレンにブロットし、その目的蛋白質のある膜の部分を切り出して 膜上でプロテアーゼ処理して測定を行うという方法もあるようです。 その辺りもう一度詳しく業者さんに確認されると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.606-2 - 2008/01/31 (木) 18:05:17 - 燐太郎 FLAGタグを付加したタンパク質を培養細胞で一過的に発現させ、免疫沈降法で精製したところCBBで見えるほどには精製できなかった。そういうことがあるのか？ということをお尋ねでしたら、それは目的タンパク質に依るし、よくあることだと思います。頑張って培養のスケールを上げる、トランスフェクションの効率を改善する、プロモーターを強力なものに代えるなど、状況によっていろいろ改善の余地はあると思います。

培養細胞からのタンパク質精製 削除/引用 No.606-1 - 2008/01/31 (木) 16:32:21 - むすくる はじめまして。このフォーラムには大変勉強させていただいてます。 タンパク質精製に疎いので質問させて下さい。 筋肉に発現している、あるタンパク質のリン酸化サイトを同定したいと思っています。そのために、タンパク質を精製し、LC-MS/MSにかけるつもりです。（LC-MS/MSは外注しようと思っています。）業者のパンフには、この手の解析のためには、CBBで染まるレベルのタンパク質量が必要である、と書いてあります。 マウスの筋ホモジネートから、細胞分画をしてある程度目的タンパク質を濃縮しましたが、泳動してSyproRuby(銀染色と同等の感度と理解しています）で染色しても、目的タンパク質は可視化できませんでした。WBでは濃縮が確認できています。 材料を変え、FLAGタグをつけた目的タンパク質をC2細胞に一過性に発現させ、FLAG agaroseで精製しました。これも免沈自体がうまくいっていることはWBで確認できましたが、SyproRubyでは染まってきませんでした（IgGなど他のタンパク質は染まっていました。） 強制発現・精製しても、目的タンパク質の量が多くなく、SyproRubyの検出限界以下なのだろうと考えていますが、そんなものなのでしょうか？ ものの本、論文には培養細胞からFLAGで精製して、CBBで見えるほどタンパク質を回収した、と書いてあるものもあるのですが、それとの違いは目的タンパク質の性質によるものなのでしょうか？ 精製に詳しい方、MS解析などをしたことのある方で、何か助言がありましたら是非とも宜しくお願いします。

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