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免疫染色の原理について トピック削除
No.595-TOPIC - 2007/12/02 (日) 20:54:51 - 初心者
最近免疫染色を始めたばかりの初心者です。
2つの質問があります。
1、一次抗体を当てる前の蛋白ブロッキングの際に使用するスキムミルクについてですが、何故スキムミルクで非特異的蛋白をブロックできるのでしょうか?また、抗体を当てる前にスキムミルクを完全に洗い流さずに抗体をのせても問題はないのでしょうか?
2、抗体をのせる時間と温度ですが、どのようなことを考慮して設定していけばいいのでしょうか?
低レベルな質問申し訳ありませんがよろしくお願いします。
また免疫染色について、参考になる資料などを御存知の方はお教えいただきたいと思っています。
 
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(無題) 削除/引用
No.595-2 - 2007/12/03 (月) 04:18:19 - ま
細かい原理は調べてみてください。

1.実用上はフィルムが真っ黒になるのを防げます。(蛍光ラベルの場合は取り込み画像が真っ白になるのを)
完全に洗い流す必要は無いです。15-30分程度tween等の入った緩衝液で洗って使っています。プロトコール集を参考にしてください。
長時間洗浄するとバックが黒くなって解析しにくくなります。

スキムミルクなのは安価でどこででも手に入るからです。
古くはBSAでも行っていたようです。

2.温度は特別な機材が必要ない温度(25度程度の室温か冷蔵庫の4度)で検討するのが良いかと思われます。室温30分から2時間、4度12時間程度を目安にやるのが日程的に楽かと思われます。
ただ、室温1時間だと当たって、4度12時間では当たらない抗体を使ったことがあります。いろいろ試してみてください。

この件に限らず専門外または初学者の内は羊土社などのプロトコール集を読んでください。

頑張ってください。

免疫染色の原理について 削除/引用
No.595-1 - 2007/12/02 (日) 20:54:51 - 初心者
最近免疫染色を始めたばかりの初心者です。
2つの質問があります。
1、一次抗体を当てる前の蛋白ブロッキングの際に使用するスキムミルクについてですが、何故スキムミルクで非特異的蛋白をブロックできるのでしょうか?また、抗体を当てる前にスキムミルクを完全に洗い流さずに抗体をのせても問題はないのでしょうか?
2、抗体をのせる時間と温度ですが、どのようなことを考慮して設定していけばいいのでしょうか?
低レベルな質問申し訳ありませんがよろしくお願いします。
また免疫染色について、参考になる資料などを御存知の方はお教えいただきたいと思っています。

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