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(無題) 削除/引用 No.589-10 - 2007/12/03 (月) 10:58:49 - antibody モノクロ さん > 二次抗体を使う理由は感度を高めるためではないですか？ そうですね･･･ 特異性改め、「感度」です。 > 二次抗体が必要か否かはケースバイケースですが、案として固層化側の抗体をＦ(ab´)2化し、二次抗体に抗ウサギＦｃ抗体を使用すれば系がワークする可能性が高いです。 なんか難しそうですね･･･ F(ab)とかFcという用語は聞いた事がありますが、 まだまだ知らないことが多いですから･･･ 参考にして、勉強しますね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.589-9 - 2007/12/03 (月) 09:00:49 - モノクロ 二次抗体を使う理由は感度を高めるためではないですか？二次抗体が必要か否かはケースバイケースですが、案として固層化側の抗体をＦ(ab´)2化し、二次抗体に抗ウサギＦｃ抗体を使用すれば系がワークする可能性が高いです。抗原を多量にお持ちなら、ラットでポリクロを作製してもよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.589-8 - 2007/12/02 (日) 17:56:42 - antibody Tさん > エピトープ（抗原）の問題は別にして、その方法だと二次抗体（抗ウサギ抗血清）はプレートに固相化された一次抗体とも反応してしまうのでは？ > どうしても同じ抗体を使いたいなら、検出用の一次抗体を酵素なりビオチンなりで標識する必要があると思いますよ。 そうなんですよね･･･ 固定されたタンパク質Ａ特異的な抗体とタンパク質Ａを反応させた後は、 ウエスタンブロットの時のように、ゼラチンなどでブロッキングできれれば良いのですが、今回は特異的な抗体が基盤ですから･･･ 一次抗体をビオチンやアルカリフォスファターゼ標識する事も勿論考えていました。 二次抗体を用いる理由はただ特異性を高めたかったためです。 基本すぎることを書き込みして申し訳ありません･･･ 一次抗体を標識する方法が妥当そうですね･･･ ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.589-7 - 2007/12/02 (日) 17:30:00 - Ｔ エピトープ（抗原）の問題は別にして、その方法だと二次抗体（抗ウサギ抗血清）はプレートに固相化された一次抗体とも反応してしまうのでは？ どうしても同じ抗体を使いたいなら、検出用の一次抗体を酵素なりビオチンなりで標識する必要があると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.589-6 - 2007/12/02 (日) 17:02:18 - antibody おお さん > 抗体はポリクロですか?エピトープ(抗原)はペプチドですか?リコンビナントですか? 抗体はウサギに抗原を免疫して作成するので、ポリクロになります。 また、エピトープは約65 kDaのリコンビナントタンパク質です。 > リコンビナントであれば抗体精製の時リコンビナントのN末半分で精製した抗体とC末半分で精製した抗体またはN-でひっかからなかった抗体に分けるなどして使った方がいいと思います。 そうですか･･･ わかりました。 アドバイス、ありがとうございます。 > 固相に吸着させる抗体と、検出に使う抗体が一緒ではうまく行かない可能性があります。 そうですか･･･ 最初の書き込みにも書きましたが、少し付け加えて書きますが、 組織中に含まれるあるタンパク質Ａのたんぱく質量を定量するために、 現段階の計画ではタンパク質Ａに特異的な抗体を固相に吸着させ、 そこにタンパク質Ａを含む組織ホモジネートを反応させる。 その後、タンパク質Ａに特異的な抗体を再び反応させ、 抗一次抗体（抗ウサギ抗血清、アルカリホスファターゼなどの酵素が標識されているもの；市販品）を反応させる。 その後、抗一次抗体に標識された酵素の基質を反応させ、その生成物の吸光度を測定する。 というような計画を立てています。 おおさんがご指摘のように、「固相に吸着させる抗体と検出に使う抗体」が同じだと難しいのでしょうか･･･？ 考え直した方が良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.589-5 - 2007/12/02 (日) 16:50:05 - antibody う〜んと さん、通りすがり さん ご回答、ありがとうございます。 そうですか･･･ ちょっと考えてみたら、少し不安になりましたので･･･ お二方のご意見を伺って、安心しました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.589-4 - 2007/12/02 (日) 00:54:31 - おお 多分お気付きだと思いますが、サンドイッチ法であれば異なる2種類の抗体を使うことになると思います。固相に吸着させる抗体と、検出に使う抗体が一緒ではうまく行かない可能性があります。 抗体はポリクロですか?エピトープ(抗原)はペプチドですか?リコンビナントですか?リコンビナントであれば抗体精製の時リコンビナントのN末半分で精製した抗体とC末半分で精製した抗体またはN-でひっかからなかった抗体に分けるなどして使った方がいいと思います。ペプチド抗体だと難しいですね。市販の抗体を探すかもう一種類抗体を作るかするべきです。

(無題) 削除/引用 No.589-3 - 2007/12/01 (土) 23:33:37 - 通りすがり 抗体のエピトープ部位は、抗原の『鋳型』に相当するわけで、抗原と類似した配列ではないと思います。 二次抗体が一次抗体のエピトープ部位に結合するのか、ということに関しては、 エピトープ部位：Y字の先っぽの部分 二次抗体が認識する部分：主にY字の根っこの部分 なので、エピトープ部位ではほとんど結合しないはずです。

(無題) 削除/引用 No.589-2 - 2007/12/01 (土) 23:17:47 - う〜んと エピトープは抗原決定基と訳しますが、これは抗原分子の一部をさします。 ご質問の文脈での用法で該当する訳語は抗原結合部位ですね。抗体分子の一部です。 通常は抗原決定部位同士が結合することはありません。

抗体と抗体の反応 削除/引用 No.589-1 - 2007/12/01 (土) 21:34:14 - antibody 抗体に関して、まだ理解していないところがあるので、どうなるのかお尋ねしたいことがあり、書込みしました。 あるタンパク質Ａに特異的な抗体を用いて、サンドイッチ法を用いて検出したいと考えています。 あるタンパク質Ａに特異的な抗体（一次抗体として使用）は現在作成中です。 完成した一次抗体をマイクロプレートに固定して、抗原（タンパク質Ａ）と反応させ、その後、一次抗体を反応させようと考えています。 さらにその後は抗一次抗体を用いて･･･と続く訳ですが･･･ そこで１つの疑問が生じたのですが、些細な事ですが、 抗体のエピトープ同士は結合するものなのでしょうか？ といいますのは、抗原を認識するエピトープは抗原に類似したアミノ酸配列を有しているのかなと思いまして･･･ まだまだ勉強不足で行き過ぎた考えかもしれませんが、どうでしょうか？ 同じ抗体のエピトープ同士は強く引かれ合うのでしょうか？

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