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(無題) 削除/引用 No.588-4 - 2007/12/02 (日) 13:46:27 - 弘法 いや、それでも通常はかまわないのですが、私がお聞きしたかったのは「植継ぎに際して、ごく稀なイベントの結果生えるようになった株を拾ってしまっている可能性はあるのか？」ということです。 いろいろ書いて分かりにくくなってしまいましたが、私としてはこれまでの情報のみから判断するにコロニーPCRの問題である可能性が高いと思っています。

(無題) 削除/引用 No.588-3 - 2007/12/01 (土) 22:30:08 - waa 弘法さんありがとうございました。 今まで、１回目の植継時にシングルアイソレーションした後に平板塗布するのみで、コロニーを分けてシングルアイソレーションしていませんでした。酵母では、植継時に常にプレート全体に塗り広げてコロニーを分けた方が良かったのでしょうか。以降は、塗り広げてやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.588-2 - 2007/12/01 (土) 17:00:36 - 弘法 ウラシルを含まないプレートで２回目に植継したときには、塗り広げた全ての細胞がコロニーを作っていますか？それとも、予想される数の1/1000以下のコロニーだけが生えてくるという具合でしょうか。 前者であれば、植継後に何らかの理由でコロニーPCRが上手くいっていないだけだと思いますよ。酵母のコロニーPCRはトリッキーなところのあるテクニックなので、トラブルの原因を解明するような決定的な実験には不向きです。きちんとDNAを調製してPCRをするか、理想的にはSouthern法でプラスミドがきちんと存在していることを調べるべきだと思います。 インサートの種類によっては、プラスミドが何らかの理由で安定に保持されないというのはあり得ることですが、その場合でもURA3遺伝子は保持されていないといけないので、単なるプラスミドの脱落よりはまれな頻度で起こるイベントであるはずなので、コロニーの数は少なくサイズもまちまちになると思われます。

S.cerevisiaeプラスミド落ち 削除/引用 No.588-1 - 2007/12/01 (土) 16:48:54 - waa 現在S.cerevisiaeにおいて、糸状菌由来の遺伝子による物質生産の系を構築中なのですが、形質転換後２回目の植継のコロニーPCRで導入遺伝子に相当する配列が増えないという現象が起きて困っています。１回目の植継(シングルアイソレーション)ではPCRで配列を確認できるのですが、２回目の植継時と同時に行っているコロニーPCRで、同じ配列が増えなくなってしまいます。 　ベクターはstratageneのpESC-Ura、宿主はBJ2168(genotype MATalpha,ura3-52,leu2,gal2,prb1-1122,1 pep4-3)を用いていました。ベクターのoriを除いたベクターを構築して、クロモソーム組込みの形質転換を試したり、宿主はプロテアーゼ欠損株なので遺伝的に不安定なのかと思い、プロテアーゼ欠損株でない宿主(invitrogen INVSc1)を用いたりしましたが、同じ現象が起きます。また、1回目の植継後、すぐに遺伝子の発現を試みましたが、やはり目的タンパク質の発現は見られませんでした。前培養の段階でPCRを行いましたが、やはり目的遺伝子の増幅は確認できませんでしたので、液倍にてプラスミドが保持できなかったためと思われます。 　現在の所対処法として、選択時の培養温度を現在の30℃からより低温に下げたり、ベクターを低コピーにしたり、薬剤耐性にすることを考えています。効果はあるのでしょうか？なぜこのような現象がおこるのでしょうか？また、薬剤耐性ではZeocinかBlasticidinを考えているのですが、併用は可能でしょうか？将来的に複数のプラスミドの導入を考えているので。どなたか同じ現象に遭遇された方で対処法を知っておられる方はご教授下さい。よろしくお願いします。

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