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(無題) 削除/引用 No.58-6 - 2007/08/21 (火) 06:01:12 - IP aさん、 ご意見どうもありがとうございます。 実は、BでIPしてAが結合することはもう見ています。確認のため逆をやりたかったのですが、下記のようになってしまいました。最近、HEKではBが組織よりもかなり多く発現していることがわかりまして、そのせいで相互作用がおかしくなっているのかな、という気がしています。もう一度、組織に戻ってやってみることにしました。Transfectionが難しいので、培養細胞でやってみたのですが、、、。

(無題) 削除/引用 No.58-5 - 2007/08/20 (月) 18:40:39 - a 根本的な解決にはならないかも知れませんが、 私なら、面倒でもAとBを逆にしてやり直すかな。 いろいろ検討している片手間にBのコンストラクトを作ってみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.58-4 - 2007/08/16 (木) 07:02:13 - IP ひろさん、たろうさん ご意見頂きましてどうもありがとうございます。 たろうさん、 タンパク質BはSDS-PAGEで約８０ｋDaに流れます。 ひろさん、 IgG＋ビーズでライセイトをプレクリアしてみましたが変わりませんでした。また、コントロールとしてIgGのIPをした時もバンドは出ませんでした。GFP、HA抗体でIPした場合のみにトランスフェクションコントロールでもバンドが出てしまいます。 IgG＋ビーズでプレクリアはしていますが、ビーズだけでプレクリアというのもあったほうが良いのでしょうか？ ご指摘のようにwashの条件をきつくしてみるのも次に試して見ます。

(無題) 削除/引用 No.58-3 - 2007/08/14 (火) 23:06:12 - たろう タンパク質Bの分子量はどのくらいですか？ 抗体のH鎖やL鎖と同程度の分子量と言うことは無いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.58-2 - 2007/08/14 (火) 17:00:59 - ひろ 多分ビーズにタンパク質Bがくっついていると思います。 1%NP40,1%トライトン,5%グリセロールで５回、1%トライトンで3回くらいwashしてみてください。あとはビーズでlysateをpre-clearなどもやってみては。

免疫沈降のバックグラウンド？ 削除/引用 No.58-1 - 2007/08/14 (火) 03:31:55 - IP IPの初心者です。 現在、ヒト培養細胞HEK293Tにタンパク質Aを発現させてAと相互作用すると思われるタンパク質Bをウェスタンで検出する実験を行っています。 タンパク質AはGFP-fusionまたはHAタグで発現させて、モノクローナルの、GFP抗体またはHA抗体を用いてIPを行いないました。ビーズにはMagnetic Dyna Beadsを使用しました。HA、GFP抗体でIPする前にマウスIgGでプレクリアをしています。細胞のLysis及び、抗原抗体結合には0.5% TritonX100を含むバッファーを、IPの洗浄には0.05％ TritonX100のバッファーを使用しています。 しかし、IP後、タンパク質B特異的抗体を用いたウェスタンでBを検出したところ、タンパク質Aを発現させたLysateからのIPだけでなく、空のベクターだけをトランスフェクションしたネガティブコントロールでも同程度のシグナルが検出されてしまいました。IPに用いたタンパク質A自身の抗体でウェスタンした場合にはAを発現させた方だけでバンドが確認できたのですが、、。ネガコンとしてTubulinを検出しましたが、インプットのみにバンドが出て、IPではバンドが出ませんでした。まるで、HA抗体、GFP抗体にタンパク質Bがくっついてしまっているような結果です。 このような場合にバックグラウンドを下げる、または特異性を上げるには、どのようにしたらよいのか、皆様のご意見をいただけませんでしょうか。

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