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(無題) 削除/引用 No.575-14 - 2007/12/03 (月) 16:18:12 - rik rikです。出題者さんの本筋から離れてしまいすみませんです。新しくトピックを立てた方が良かったかも知れませんが今更なので許して下さい。 カナマイシンさん アラビアゴムで保存なんて知りませんでしたので勉強になりました。 APさん >オートラをやっていた先輩のだれかが、この効用を取り違えてIPに適用し、それが受け継がれてきたのではないでしょうかね。 確かにこの線が強いようですね。調べてはいませんがメーカーも推奨はしないと思います。 ゲル乾燥というとSDS-PAGE／銀染色のゲルで見事にひび割れたのがトラウマになっています。TBEで作ったゲルや尿素変性ゲルではひび割れの心配は少ないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.575-13 - 2007/12/03 (月) 10:27:46 - AP IPへのexposureをフリーザー中でおこなうというのは、メーカーが推奨、あるいは容認している方法ではないと思いますが、いかかでしょう。それであればやらないほうがいいです。 フリーザーに入れることがゲル内でのバンドの拡散を防ぐことに効果があるのか、またそれが必要なのかはよくわかりません。しかし、拡散を防ぐのが目的ならゲルドライヤーで乾燥させるのが一番いいと思います。オートラでシークエンスをしていたころは良くやっていたものでした。シークエンスゲルはサイズが大きいものの薄いので失敗したことないです。ゲルシフトだとゲルの厚みがもっとあるので生乾きや乾燥ムラで割れてしまう心配はありますが、いい条件を見つければ心配ないと思います。 また、シークエンスでバンドの拡散を防ぐのに、酢酸や酢酸エタノールを吹き付けて固定していたこともありますが、ゲルシフトなどにも効果があるでしょうか。 ところで、フィルムでオートラジオグラフィをとるときは、ディープフリーザーに入れるということを良くやりますが、これはまた別の理由です。 被曝してしてフィルム上に生じた銀粒子はある程度、自然に逆反応が起こってイオンに戻ります。低温にすることで逆反応を抑制して銀粒子の蓄積を効果的に行うというのがその理由です。 オートラをやっていた先輩のだれかが、この効用を取り違えてIPに適用し、それが受け継がれてきたのではないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.575-12 - 2007/12/03 (月) 04:00:07 - カナマイシン 訂正というか補足です。 アラビアゴムでの固定法はSDS-PAGE後クマシー染色したゲルの保存法として 用いられているようです。 クマシー染色の時には蛋白は固定済みですが、 核酸電気泳動後ゲルのサンプル拡散がアラビアゴムで 防げるかどうかは未経験でわからないです。 やはりゲル乾が無難ですよね。よく失敗するんですが・・・

(無題) 削除/引用 No.575-11 - 2007/12/03 (月) 03:53:16 - カナマイシン >rik様 長い露光時間が必要な実験で、かつ何らかの理由でゲル乾できない （機械が無いとか不調とか／ひび割れてしまう可能性が高い／めんどくさい） 場合には、冷凍庫に放り込んでおけばゲルの収縮や拡散が防げて良いようです。 -80度に放り込んでるラボメンバーを見たことがあります。 結露しないのかな、と心配でしたが･･･。というか結露しますよね、やっぱり･･･。 横着だったらなんと贅沢な。 ゲル乾以外にはアラビアゴムで覆うという方法も見たことがあります。 やったことはないです。

(無題) 削除/引用 No.575-10 - 2007/12/03 (月) 02:30:03 - rik カエルさん、カナマイシンさんコメントありがとうございます。 カナマイシンさん同様にまずゲルを濾紙に貼付けてからラップに包んで露光させています。フリーザーに入れるのは先人の受け売りでして、何故そうしたかについて尋ねた事はありませんでした。皆さんのコメントを見て、確かに乾燥させればよいし、拡散もそんなに心配しなくてよいことに気付きました。ラボの先輩は乾燥が面倒だったのでしょうか。今後はイメージングプレートを労って室温で露光させてみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.575-9 - 2007/12/02 (日) 22:33:36 - カナマイシン >rik様 カエル様と同じことをお聞きするのですが 「そのまま」ラップにくるまれているのですか？ 当方はまずゲルより少し大きめの濾紙に貼り付けます （泳動後のゲルに濾紙を押しつける）。 更に完璧を期するのならゲル乾でしょうが、 ゲルシフトは非常にシグナルが強いので、 当方はそのままラップにくるみ室温で 30 分露光してます。 1 時間以上露光するとバックグラウンドが汚い印象です。 この辺はラベルの仕方にもよるのかもしれませんが。 ２−３時間程度までであればバンドの拡散やゲルの縮みは見られていません。

(無題) 削除/引用 No.575-8 - 2007/12/02 (日) 11:17:54 - カエル rikさん 泳動後のゲルをそのままサランラップで包んで露光されているのでしょうか？一般的に、泳動後のゲルをゲルドライヤーで乾燥し、フィルムに露光すればいくつかの問題は解決出来るのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.575-7 - 2007/12/01 (土) 20:58:55 - rik 便乗して質問させて下さい。 現在のラボではRIゲルシフトアッセイのゲルをサランラップでくるんだ後、GEヘルスケアのイメージングプレートに挟んだものを-20度フリーザー中で露光しています。露光中にバンドが拡散しないための配慮とはいっても、これをやるとプレートが次第にたわんできますし、室温に戻すときの結露も少し起こります。最近のプレートは耐水性も向上したようですがちょっと不安でもあります。イメージングプレートでやられている方、何か工夫されていることなどありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.575-6 - 2007/11/30 (金) 20:09:31 - a カナマイシンさん、大変参考になりました。ありがとうございます。 RIに基本的な装置はすべて入れてありますが、立場上あまり長くラボを空けることができないため、できればコールドでできればと思っていました。 春休みにRIとDIG両方で検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.575-5 - 2007/11/30 (金) 10:14:34 - カナマイシン >a様 余計な意見かもしれませんが、RIゲルシフトで半減期は意外と気になりません。 結局は絶対的な定量はほとんどの場合必要が無くて、 必要なのはせいぜい比 （インプット：シフトバンドとか、ノンシフトバンド：シフトバンドとか）なので。 私は到着後２週間くらいなら平気で32Pプローブを使い回してます。 場合によっては更にもう少し経っても使ってしまいそうです。 なんせ検出がラクなので。 私がメンブレンワークがあまり好きではない、というごく個人的な理由もあります。 もちろんご所属の機関におけるRIの利用環境にもよりますけれども、もしご参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.575-4 - 2007/11/30 (金) 09:48:35 - a APさん、カナマイシンさん貴重なご意見ありがとうございます。 　DIGラベルでも感度に問題無いのは良いですね。RIラベルですと半減期があるので条件検討でするには抵抗があるなあと思っていました。 　CDP-Starがまだ残っているので、とりあえずDIGでやってみようかなあと思います。 　とりあえず、このトピックスは閉めます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.575-3 - 2007/11/28 (水) 21:01:57 - カナマイシン 私もAP様と同じものを使って、だいたい同じ感想です。 ただ、ラベリングはキット内包のターミナルトランスフェラーゼを使いました。 プローブの保存が半永久的にできるのは助かります。 私はRIも平行して使っているのでそれと比較すると、 ・感度に関しては現在まで困ったことはない。 ・non-RIだと、メンブレン転写の際に「濾紙-ゲル-メンブレン-濾紙」間の 　空気を抜くという作業があるが、この工程でどうしてもゲルがゆがみ、 　最終的に像がゆがんでしまう（誰か解決法をご存じであれば教えてください）。 ・同じ蛋白、同じゲル、同じバッファーでも、 　non-RIだとなぜかバンドがスマイリングする（同上）。 ・RIの方が、危険ではあるが工程としては圧倒的に早くてラク、像もきれい。 　32Pがもっと保存できればいいのにな〜。 という印象を持っています。 なので、私は条件検討や確認実験にはRIとnon-RIを半々、 Figure作成時にはできるだけRI、という形でやってます。 あ、横道にそれますがロシュの上記キットの日本語版マニュアルは 間違いがたくさんあった（今はわからないけど）なので、 必ず英語版も読まれるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.575-2 - 2007/11/28 (水) 19:35:09 - AP Rocheのは使っていました。 DIGラベルで最終的にはAP/CDP-Starのケミルミ検出です。 キットにはterminal transferaseで末端にプローブ末端にDIG-ddUTPを一分子をつけるラベルシステムが含まれていますが、主にプライマー合成を末端DIGラベルでオーダーしてPCRでプローブを作ってやっていたと記憶します。 これだと、普段DIG/ケミルミのシステムを動かしている研究室なら、専用のキット使わないでもすぐ出来ます。 メンブレンはメーカー推奨のものが一番いいと思います（Roche Nylon positive charged）。 RIでも検出に苦労する、というようなものでなければ感度は十分だと思います。 ただしステップ数が多い分だけ、各ステップ毎のわずかなロスの積み重ねで性能を発揮できなくなりますので雑にやるとだめです（感度が悪いという主張はこれが理由であること多し）。

non-RIゲルシフトアッセイ 削除/引用 No.575-1 - 2007/11/28 (水) 18:40:26 - a 　いつもお世話になっています。 　non-RIのゲルシフトアッセイをお試しになられた方の感想を聞きたいんですが。 　non-RIのキットとして、ロシュのDIGラベリングやB-Bridgeのケミルミを利用したキットなどがあると思いますが、RIの時と比べ感度などは十分でしょうか？ 　また、これらの方法だとメンブレンに転写する必要があると思いますが、メンブレンの種類やメーカーを教えていただけると助かります。

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