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ありがとうございました。 削除/引用 No.567-10 - 2007/11/27 (火) 19:47:48 - なんで？？ ご回答頂いた皆様ありがとうございました。 RNaseを疑いながら、再度調整したいと思います。 【中年さま】 ご丁寧な回答ありがとうございました。 多々、勉強させていただきました。 実は、ミニプレップのKitでの精製では、 バンドが確認出来ておりました。 しかし、収量が少なく、大量培養に変更したところ、 バンドが消失・・・。 なんで？？と困り果てておりました。 本当にありがとうございました。 【ご回答頂いた皆様】 貴重なお時間を割いて頂きありがとうございました。 大変参考になりました。 深く感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.567-9 - 2007/11/27 (火) 19:13:42 - 中年 バンドが見えないとは重症ですね。でも、ほとんどのDNaseはEDTA存在下では活性が無いから、TEに溶解したものをそのままTAEで泳動したなら切れるステップはないと思います。 と言うわけで、私も見えているスメアはRNAである、に一票。 pGEXプラスミドはコピー数の低いpBR系の複製起点を持っていることはご存じですか？キアゲンのマニュアルにも、pBR系のプラスミドの場合には培養の容量を増やすように指示があったと思います。もし、他のpUC系のプラスミドと同じ培養容量から精製されたとしたら、プラスミドの収量はずっと低いですよ。 その場合、RNAが残った理由は謎ですが、RNaseAがへばってるのかもしれません。 また、余計なお世話かと思いますが、pGEXプラスミドでしたら発現プラスミドを構築した後には発現用の大腸菌株に導入することになると思いますので、高価なEndoFreeのキットを使う理由は全くないと思います。 また、pGEXのプラスミドを買えば10μg入ってると思いますが、これだけあれば発現用のコンストラクトが20個は楽に構築できると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.567-8 - 2007/11/27 (火) 18:58:57 - なんで？？ >[Re:6] 中年さんは書きました : > 切断していないcccのプラスミドが低分子側にスメアしてるんですか？ はい。 > どこかにヌクレアーゼのコンタミがあってプラスミドDNAが切れてしまうことが原因で低分子側にスメアしてるとすれば、cccに加えて大量のocやリニアのDNAがバンドとして見えるはずだと思いますが、そういう状態になっているでしょうか？ バンドは一切見えません。 cccなので、正確ではありませんが、 ほぼ目的プラスミドのサイズから低分子側にバンドらしきものも無くスメアです。 まだ開封したばかりのKitではあるのですが、 RNaseが失活していた場合、 どのようになる可能性があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.567-7 - 2007/11/27 (火) 18:51:18 - K RNase液にDNaseがコンタミしてる可能性があります。 RNase処理の前に、チューブごとボイルしてみては？ それで、DNaseが死ぬでしょう。

(無題) 削除/引用 No.567-6 - 2007/11/27 (火) 18:34:30 - 中年 切断していないcccのプラスミドが低分子側にスメアしてるんですか？ どこかにヌクレアーゼのコンタミがあってプラスミドDNAが切れてしまうことが原因で低分子側にスメアしてるとすれば、cccに加えて大量のocやリニアのDNAがバンドとして見えるはずだと思いますが、そういう状態になっているでしょうか？ そうではなくって、cccの位置にバンドがあって、さらにそのバンドから下にスメアを引いているのであれば、何かがDNAに結合して泳動度を早めているのかもしれません。どのくらい下まで（DNAのサイズにして）スメアを引いていますか？

(無題) 削除/引用 No.567-5 - 2007/11/27 (火) 18:25:44 - なんで？？ >[Re:4] 中年さんは書きました : > スメアって、本来の泳動位置に対してどっちの方向にスメアしてますか？ > 低分子側？高分子側？両方？ 低分子側です。

(無題) 削除/引用 No.567-4 - 2007/11/27 (火) 18:24:28 - 中年 スメアって、本来の泳動位置に対してどっちの方向にスメアしてますか？ 低分子側？高分子側？両方？

(無題) 削除/引用 No.567-3 - 2007/11/27 (火) 17:55:14 - なん >[Re:2] h-izさんは書きました : > RNAのコンタミではないですか？ 早速の書き込みありがとうございます。 精製過程でRNaseを添加しております。

(無題) 削除/引用 No.567-2 - 2007/11/27 (火) 17:34:27 - h-iz RNAのコンタミではないですか？

精製プラスミドがスメアです。 削除/引用 No.567-1 - 2007/11/27 (火) 17:31:40 - なんで？？ 現在、下記ステップにて購入プラスミドの増幅＆精製を行っております。 １）購入したプラスミド（pGEX-6P）を大腸菌（DH5α）へ形質転換 ２）前培養→大量培養 ３）キアゲンのEndoFree Plasmid Maxi Kitで精製 しかし、アガロース電気泳動をすると、 バンドがスメアになります。 これまでにいくつものプラスミドをこのKitで精製してきましたが、 バンドがスメアになるのは初めてです。 電気泳動時の濃度の影響があるのか？と考え、 濃度を希釈方向にふりながら数サンプル行いましたが、 全てスメアです。 形質転換時に、Amp存在下でコロニーが出来たものを培養しているので、 目的プラスミドが入って無いとは考えられません。 購入プラスミドでこの様な状態にあり、 実験のスタートが切れません。 どんな原因が考えられ、どの様な対策を講じれば良いのか・・・ どうかご助言を頂きたく存じます。

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