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(無題) 削除/引用 No.565-6 - 2007/11/29 (木) 02:15:48 - tank-3 ＞キットさん ありがとうございます！ こちらのキットはさらに膜画分以外も分離できるのですね。 このキットはラボで持ってる人を見つけたのですぐに実施できそうです。 やはり、オルガネラと細胞膜を分けるのは難しそうですね… 今回は膜画分分離→ウェスタン、FCM、IFAを実施して全ての結果を照らし合わせて判断するのがいいのかなと思いました。 手間はかかるかもですけど、結果を組み合わせれば正確な判断ができそうだと思えてきました。 大変助かりました！

(無題) 削除/引用 No.565-5 - 2007/11/27 (火) 23:33:07 - キット 細胞分画キット Subcellular ProteoExtract Kit（S-PEK）　製品番号539790 動物細胞から, 細胞質-膜･オルガネラ-核-細胞骨格マトリックス各画分のタンパクを連続単ステップで分画抽出できます http://www.cosmobio.co.jp/product/products_NVG_20040301.asp こんな調子のが、いちばん正統派かも。ただ、１００％分けられないのが普通です。第二候補はしたのIFA。 Flowは高いシグナルが得れれば、代替案になるというような感じでしょう。

なるほど… 削除/引用 No.565-4 - 2007/11/27 (火) 23:07:43 - tank-3 さっそくのお返事ありがとうございます！ ＞Bioさん 確かにbiotin-avidinの精製法を使えば細胞膜のタンパク質だけをとってこれそうですね。手法自体、私はまだ未経験なのでどの程度バックグラウンドが高いかは分らないのですが、一つの選択肢として考えてみます。 確かに、コントロールの取り方が難しいですね。 ＞His-Tagさん IHCはやったことあるのですが細胞を扱い始めて間もなかったので、IFAという手法を初めて知りました。 やはりIFAでもそれなりにバックが高くなるものなのでしょうか？ これで細胞膜がばっちり染まったらうれしいですが、全体が染まったとしても抗体のスペックが分かりそうですね。 とりあえずは、もう一回Flowcytometryにかけて再現性を見つつ紹介していただいた手法がラボで実施可能か検討してみますね。アドバイス、どうもありがとうござます！

もしくは... 削除/引用 No.565-3 - 2007/11/27 (火) 20:23:47 - His-Tag とりあえず、IFA できれいに細胞膜あたりが染まることを確認したらいかがでしょうか。 もちろん、バックが高くて明瞭な像は得られないかもしれませんが、抗体のスペックがはっきりして次の戦略の決定材料にはなると思います。

(無題) 削除/引用 No.565-2 - 2007/11/27 (火) 17:08:53 - Bio 細胞膜画分を分離精製というやり方とは異なりますが、細胞表面を生きたままBiotinラベルし、細胞溶解後Biotin化蛋白をAvidinビーズで回収、SDS-PAGE後その分子に対するウエスタンをすれば、その蛋白が細胞表面にあったかどうかわかると思います。コントロールをどうとるかなど、ちょっとややこしそうですが。 もっといいやり方があるかもしれませんし、間違っていたらすみません。

ある蛋白が細胞膜にあるかどうかを調べるには？ 削除/引用 No.565-1 - 2007/11/27 (火) 15:54:53 - tank-3 現在、あるタンパク質がヒトcell-lineの細胞膜に発現しているかどうかを確かめる実験をしています。 ポリクロの市販抗体が手に入ったので、まずはフローサイトメトリーにかけてみたのですが、多少はピークシフトが見られたものの、とても渋い結果となってしまいました。バックグラウンドとしても多少ピークシフトが起こる可能性と、抗体がポリクロであることを考えると、このタンパクが本当に細胞膜上にあるのかを未だ断定できない状態です。 『The Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit』という膜画分を分離するキットのことを知ったのですが、どうやらミトコンドリアなどのオルガネラの膜も含む形で分離されるようです。 すみませんが、どなたか哺乳類の細胞膜画分のみを分離・精製してくるような手法・キットをご存じないでしょうか？ どうぞよろしくお願いします。

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