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経過報告 削除/引用 No.556-4 - 2007/11/30 (金) 13:31:27 - aa おおさん、う〜んとさん。アドバイス有難うございました。 また、お返事遅くなりまして申し訳ありませんでした。 変異クローンを拾った可能性を考慮して、発現を確認している大元のプラスミドを探し出して再度トランスフォーメーション、コロニーのピックアップ、mini-prepを試みました。 得られたクローン複数を制限酵素切断処理した結果、全て同様のパターンを示し、未切断プラスミドの泳動像も通常のパターン(前回の泳動度の早いバンドは見えず)を示しました。 これらのうち２クローンを再度培養、midi-prepで回収し、一部を制限酵素処理、電気泳動を行いました。 その結果、切断群はどちらも予想されるパターンだったのですが、未切断群で再び泳動度の早いバンドが出てきました...どうもラージスケールでの精製時にエキストラバンドが出てくるようです。 確かな判断はできないのですが、切断群では同等のバンドが確認されないので、このエクストラバンドはプラスミドが高次構造をとっている物なのだろうかと判断しているのですが... とりあえず今回得られたプラスミドを導入して発現を確認してみようと思います。タンパク質発現には影響しないのかもしれませんが、みなさんこのようなエキストラバンドが出てくる現象にご経験はありますでしょうか？ タンパク質発現に影響が出るようならプラスミド骨格の変更、あるいは大腸菌を替えるなどを試したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.556-3 - 2007/11/26 (月) 15:06:42 - う〜んと プラスミドを増やすのに大腸菌の形質転換からやり直すときは、変異体を拾ってしまって後工程で悩むのが嫌なので、複数クローンを拾うようにしています。 大腸菌の中で変異が入る確率自体は低くても、数十ミリリットルでも培養時の菌体数を考えると変異体が優占してしまう可能性は十分あると思います。シングルを拾ってそいつがたまたま変異体だと元の配列を持ってるクローンを失いかねませんので。 複数クローンをまとめて拾って塩基配列の確認すると、複数の配列が混ざってることもありました。その時はたまたまシーケンスプライマーの近くで変異が入っていたので気が付きましたが、そうでないと見過ごしていたかもしれません。 同じベクターでも挿入配列によって”おかしなこと”の起こる頻度は違いますし、株によっても違います。 大量調整したプラスミドを再増幅する時はとくに注意が必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.556-2 - 2007/11/26 (月) 13:11:12 - おお 収量が突然上がったとかないでしょうか。大変まれなケースですが、からの発現ベクターを大腸菌に入れ直して、シングルクローンをえ増やして使おうとした時、制限酵素処理では異常が見られなかったので、そのまま切ったベクターを使ってライゲーションを行ってクローンを得たところ、得られたクローンは高頻度でインサートが入っているよう何ですが、どうもインサートとプラスミドの期待したところで制限酵素が切らない、なんか変なことばかりおこることがありました。それとなくオリジナルのプラスミドをトランスフォーメーションしてもう一度プラスミドを得たところ、うまく行ったと言うのを見たことがあります。非常に運悪くへんなクローンを拾ったようです。もし、一つしかクローンを増やしていないのならトランスフォーメンションし直すか、プレートが残っていればもう一つピックアップしてみれば解決するかもしれません。で安定性とか気になる時はチョット違う種類の大腸菌を使ってみてもいいかもしれません。理屈を考えて株を選んでもいいかもしれませんが、ま相性みたいな物と考えてランダムに違うものでもいいかもしれません。

プラスミドの異常？ 削除/引用 No.556-1 - 2007/11/26 (月) 11:57:46 - aa いつもお世話になっております。 これまで使用していたプラスミドの発現が認められなくなるという現象に悩んでいます。 ある遺伝子AのN末端にFlag-tagをつけたプラスミドを構築し、293T細胞にLF2000法にて定法に従い導入します。同時に同じ骨格に遺伝子Bを組み込んだものを導入したサンプルを作製し、導入24時間後の細胞溶解液をanti-Flag抗体で免疫沈降し、WBにてP.O.標識したanti-Flag M2抗体を用いて検出しました。 その結果遺伝子Bは予想される位置にシングルバンドとして検出されるのですが遺伝子Aについてはまったくバンドを検出することができません。 実は遺伝子Aを組み込んだこのプラスミドは以前は上記の方法で検出できていました。ところが新しく大腸菌に入れなおして、増幅して精製したものを用いると発現しなくなりました。 精製後のプラスミドは吸光度を測定し、キット(Q社)を用いた場合に期待される量、純度(260/280)を回収していることを確認し、アガロース電気泳動でも確認しています。 ただし、電気泳動に際してスーパーコイルより泳動度の早いバンド(スーパーコイルやリニアーの1/10より薄いバンド、遺伝子Bのプラスミドでは認められない)を確認しています。 また、これまで発現を確認できた遺伝子Aのプラスミドと発現しなくなったプラスミドの制限酵素処理後のバンドパターンは一致することも確認しています。 上記の結果からこのプラスミドの安定性が悪いのではないか？と考えているのですがこのような経験をされた方、対処法などご教示いただけないでしょうか？ ちなみに、これまでにこの骨格を用いて複数種類の遺伝子を組み込んで発現を行っていますが、この遺伝子Aに限ってこのような現象が起こっています。 宜しくお願い致します。

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