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(無題) 削除/引用 No.554-10 - 2010/02/02 (火) 19:41:06 - yuri もう結構前、学生の頃によく同じように胎性後期やP0〜P6のマウスの潅流固定を行っておりました。胎生期は母親ごと固定し、胎仔を取り出してました。生後は1mlシリンジに何Gか忘れましたが針を付け、PBS　0.5ｍL（マウスののどのあたりの血管が見えなくなるくらい）→シリンジを付替えて固定液（PFAなど）2.5ｍLを手動で潅流しておりました。口や鼻から液が吹き出すとうまくいきません。 固定されていなかったのは、固定液の量の問題かな？と思います。

灌流固定した組織の硬さ 削除/引用 No.554-9 - 2009/07/16 (木) 23:11:07 - notabene 　いつも大変参考にさせて頂いております。 当方、灌流固定を行ってマウス脳サンプルを作製しておりますが、灌流固定後に脱脳してみますと、通常やっていたときよりも硬さがありませんでした。 　生食で脱血後、４％PFAで行っており、PFA変換後に痙攣、硬直もみられるのですが、肝心の組織は通常の灌流固定後よち柔らかくなりました。 　試薬の温度なども考えてみたのですが、こちらの過去のトピックスを拝見したところ、試薬の温度には特に問題がないように思えました。 　大変恐縮ではありますが、お力をお借りできればと存じます。何卒よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.554-8 - 2007/11/29 (木) 06:17:32 - ねずみ 灌流前に右心房を切ることもお忘れなく。これを忘れると、かなりの確率で脱血が不十分になります。 胎生後期だと、とても小さいですが、その場合、はさみなどを使わずに、刺入前の針先で軽く傷を付けるような感じで十分に穴が開きます。

(無題) 削除/引用 No.554-7 - 2007/11/28 (水) 17:40:12 - Eire しまさん 具体的な手技の解説どうもありがとうございました。 > 針を刺すときには、心臓の中ほどまでの距離で針先を曲げておくと、 > （角度は好みですが、わたしは45-60℃位で角度をつけています） > 針を刺した後にも中に入っている針の長さを判断できますし、 > 引っ掛けるように支持ができるので、ブレることも無くなります。 > 何度も刺して余計な穴を開けないようにすれば、大動脈まで針を > 入れなくても間違いなく灌流できます。 なるほど、これは非常に参考になりました。次回固定を行うときに是非試してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.554-6 - 2007/11/28 (水) 09:51:21 - しま 灌流固定ではないですが、灌流はルーティンでやっています。 Adultなので、あまり参考にならないかもしれませんが、 10mLのシリンジに（一度に数匹分セットしているため） 24Gか25Gのニードルをつけ、0.1mL/1secのイメージで （手動なのでｗ）、プランジャーを押しています。 あまりゆっくり過ぎると（圧が低すぎると）抜けが悪く、 毛細血管まで灌流できていないことが多いです。 P12で行ったときには26Gニードルを使用していました。 灌流固定であれば、足や肝臓から血の気が無くなりますし、 マウスが伸びをするように足を伸ばします。 針を刺すときには、心臓の中ほどまでの距離で針先を曲げておくと、 （角度は好みですが、わたしは45-60℃位で角度をつけています） 針を刺した後にも中に入っている針の長さを判断できますし、 引っ掛けるように支持ができるので、ブレることも無くなります。 何度も刺して余計な穴を開けないようにすれば、大動脈まで針を 入れなくても間違いなく灌流できます。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.554-5 - 2007/11/27 (火) 19:02:54 - Eire aaa_kkk123 さん ご回答ありがとうございます。 > 私は、P0,P5,P7,P10あたりのマウスにFITC-dextranを灌流しています。 > 灌流方法は、自動ですか？手動ですか？ P0-P4 くらいまでは手動、それ以降はペリスタポンプでトライしています。 > 私は手でゆっくり灌流しています。 > 1ml 26Gのシリンジで、先に0.2umの滅菌フィルターをつけて行っています。 なるほど、具体的な手技のご説明ありがとうございます。 P10 あたりでも固定液 1 ml で十分固定できるのですね。 > 灌流固定がうまくいかないのは血がきれいに抜けていないということでしょうか？ はい。というより、私の経験、技量不足であることは分かっているのですが、注射針を左心室に刺すとき上手く入ってくれないようなのです。あと、刺した後注射針を動かさないように固定するのに苦労しています。注射針をどの位の深さまで入れたらよいのか、あと針はどのように固定すればよいのか、何かアドバイスありましたらお願いします。誰か熟練した人の手技を見させてもらえばよいのでしょうが、周りにそのような人がいないもので・・・・

参考になれば 削除/引用 No.554-4 - 2007/11/27 (火) 11:13:30 - aaa_kkk123 私は、P0,P5,P7,P10あたりのマウスにFITC-dextranを灌流しています。 灌流方法は、自動ですか？手動ですか？ 私は手でゆっくり灌流しています。 1ml 26Gのシリンジで、先に0.2umの滅菌フィルターをつけて行っています。 灌流固定がうまくいかないのは血がきれいに抜けていないということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.554-3 - 2007/11/25 (日) 17:15:00 - Eire ななしさん 早速のご回答ありがとうございます。 > 凍結切片では、ダメなんですかね？ > 生後2週くらいなら、頭蓋骨ごと切れると思いますが。 > 切片の質を求められるなら、川本法というのがありますよ。 あくまでも幼若マウスの灌流固定における tips ということでよろしくお願いします。 ちなみに当方、アガロースに包埋した脳をビブラトームで 50 (免染)-100 (E15 brain の ISH) um 厚に切った物を使っています。切片が厚い分解像度は落ちますがシグナル強度を上げやすく、また ISH の際プローブを短くする必要もなく、12-well plate １枚で脳１つ分の発現が解析できるので重宝しています。川本法（フィルム法）が良いというのは、以前ここのトピックでも挙げられていましたね。 もう１つ灌流固定したい理由で挙げられるのが、マウスで作製された抗体をマウスに用いたい時があり (mouse on mouse)、これも Mouse on Mouse kit を使ったり予め１次抗体と２次抗体の複合体を作ったりする方法があるのは知っているのですが、脳の場合 PBS と PFA を灌流させて血液を洗い流すのが、バックグラウンド染色を抑えるための一番手っ取り早くて確実そうだというのがあります。

灌流ではないですが 削除/引用 No.554-2 - 2007/11/25 (日) 11:37:23 - ななし 凍結切片では、ダメなんですかね？ 生後2週くらいなら、頭蓋骨ごと切れると思いますが。 切片の質を求められるなら、川本法といううのがありますよ。

幼若マウスの灌流固定法 削除/引用 No.554-1 - 2007/11/25 (日) 09:46:37 - Eire いつも参考にさせていただいています。 この度胎生後期から生後 2 週間までのマウス脳に対して in situ hybridization および免疫組織化学を行うことになりました。そこで、できるだけ速やかに深部まで固定を行うために灌流固定を行いたいのですが、液 (PBS -> 4% PFA) がなかなか上手く灌流してくれません。基本的には成体マウスと同じ手順でよいと思うのですが、胎生期あるいは生後すぐのような小さい個体に対して灌流固定を行う際、こういうところに気をつけたらよい、とか、こういう道具を使うとやりやすい、などといったコツがございましたら、どんな小さなことでも良いのでご教授下さいませんでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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