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(無題) 削除/引用 No.549-8 - 2007/11/24 (土) 13:32:58 - Fresh ＞バッファー懸濁後、Freeze and thawを繰り返すというプロトコールもあります。 そのとおりですね。手間と時間がかかるので最近はやる人はあまりいないかもしれませんが、超音波破砕によるダメージを避けたいときや界面活性剤を極力使いたくないときには今でも有効です。 グリセロールを入れるのは凍害による菌体のダメージを防ぐ意図だと思いますが、どうせ溶菌するためのものなら必要ないと思います。 おそらく、超音波処理で菌体がほとんど壊れていないから目的のタンパク質が検出できないのでしょう。処理後の上清だけでなく、沈殿のほうもSDS-PAGEすれば、おそらく存在が確認できるでしょう。超音波処理の条件検討をするというのがひとつの解決法でしょう。 別な解決法としては、Triton-X100を含むバッファーを使っておられますが、ライセートに界面活性剤が入ってもよいのであれば、lysozymeと0.5-1%のTritonまたはNP-40だけで十分溶菌できます。冷蔵庫やコールドルームのなかで、コニカルチューブにでも入れてローテーターで転倒混和、あるいはビーカーに入れてスターラーで緩やかに攪拌すれば30分から1時間くらいで完全に溶菌するでしょう。 超音波処理と違って、高分子DNAがせん断されないため粘性が出ますが、同時にDNase I（RT-PCRにつかうような高品質なものではなく安いcrudeな粉末品などでOK)を入れておくか、溶菌後に注射針を通すか超音波処理をして物理的にせん断すればよいです。

(無題) 削除/引用 No.549-7 - 2007/11/24 (土) 08:07:13 - BL 大腸菌を冷凍するのはよくない、という意見も多いようですが、菌体破砕という面ではむしろ推奨されるべきものでは？バッファー懸濁後、Freeze and thawを繰り返すというプロトコールもあります。 間違っていたらすみません。

ご意見ありがとうございます 削除/引用 No.549-6 - 2007/11/24 (土) 01:28:05 - だるまや 皆さん丁寧で詳しいご説明ありがとうございます。 　銅鑼さんの抗体を用いての染色を検討してみたいと思います。また各ステップにおける発現の具合をチェックしてみたいと思います。 　ecoさんとカナマイシンさんの冷凍保存条件は大変参考になりました。実は以前のバッファーはグリセロールの代わりに10％エチレングリコールを使っており、-20℃よりも-80℃の方が冷凍できると聞いたのでそうしました。今度はアドバイスを参考に再検討してみたいと思います。そしてカナマイシンさんのご質問ですが１でした…。これからはソニックをきちんとやっておきたいと思います。またクロマトのタンパクピークですが確認せずに遠心濃縮を行ってしまいました…。これからは注意したいと思います。 　ポンさんの検鏡での確認は盲点でした。ぜひやってみたいと思います。 　まだ実験の途中ですが皆様のご意見を参考にやってみたいと思います。貴重なアドバイスありがとうございました。 　（もしまた何か他にありましたら、あつかましいのは承知の上ですがよろしくお願いします。）

(無題) 削除/引用 No.549-5 - 2007/11/23 (金) 22:24:55 - ぽん 大腸菌が破壊されているか否かは、検鏡で確認されましたか？ 一番簡単に且つ確実に確認できますよ。

(無題) 削除/引用 No.549-4 - 2007/11/23 (金) 15:14:42 - カナマイシン 最初の「発現の有無をSDS-PAGEで確認」というのは、 １．菌体ごとゲルにアプライした ２．集菌して（冷凍せずに）ソニックしてアプライした ３．集菌して（冷凍せずに）ソニックして遠心で可溶性／不溶性にわけてアプライした のどれでしょうか？　もちろん３が望ましいと思います。 冷凍時にはバッファーを入れず、上清を除いた菌体のみで、というのはeco様と同意見です。 水分子が液体から固体に変化するときの細胞へのダメージは相当大きいようです。 私なら、そういうことが起こるのであれば-80は避け-20にしそうです。 保存の期間にもよりますけれども。保存する必要ないのであれば毎回調製します。 ソニック→硫安分画→クロマト→濃縮、をしたのであれば、 各ステップの前後でのSDS-PAGEによる確認は必須と思います。 特に硫安の前後は必要だと思います。 クロマト、蛋白ピークはなかったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.549-3 - 2007/11/23 (金) 14:26:07 - eco バンドがなくなった原因は文章からのみでは判断しかねますが、以下参考意見を。 菌体を-80℃に保存せず、破砕・精製を行うのがよいと思います。 仕方なく-80℃保存する場合は、bufferに懸濁せず、集菌後に上清を除いて水気を取った状態で冷凍するのがよいと思います。 破砕条件ですがBL21ならリゾチーム無しでも、その条件で5分も超音波処理すれば破砕されると思います。精製条件が分からないのであれですが、破砕する際に懸濁するbufferはもう少し塩濃度が高いの（私はグリセロール無し、リン酸バッファー+0.1M NaClでやってます）を使った方がいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.549-2 - 2007/11/23 (金) 04:43:03 - 銅鑼 すべてのステップが怪しいとしか言いようが無いので - 発現の有無の確認がCBB染色等であれば、そのタンパク質、或いはタグに対する抗体で確認を行う - 菌体破砕前、後の上清、沈殿、精製前、精製後、濃縮後等でのタンパク質の確認を行う 以上2点辺りで、どこがうまくいっていないのかまず確認するのがよいのではないでしょうか。

タンパク精製における菌体の溶菌について 削除/引用 No.549-1 - 2007/11/23 (金) 01:23:59 - だるまや 　植物固有に存在するキナーゼについて研究している者です。実験でいきずまっているのでアドバイスをいただきたいと思っています。 　 　トランスフォーメーションをしたBL21を37℃で震盪培養し、OD600で0.5付近になったところでIPTGを最終濃度が0.25mMになるように投入し37℃、3時間培養しタンパクを作成しました。誘導前後の発現の有無をSDSPAGEで確認したところきちんと発現していました。そして、この菌体を特別なバッファー（10%グリセロール、Tris-HCl、NaCl、TritonX100）に入れてボルテックス後-80℃で保存しておきました。 　 　翌日ソニケーション処理（最大パワーで15秒5回）をしようとしたところ菌液がクリアにもトロロ状のどろどろしたものにもならず変化がありませんでした。今度は別のサンプルを用いてリゾチームを投入したのですがこの場合でもまったく変化が出ませんでした。その後、硫安処理（一応沈殿は出ました）、アフィニティークロマト、遠心濃縮を行い、SDSPAGEでチェックしたところバンドがまったく出ませんでした。 　 　これは何が問題だと思われますか？バッファーはグリセロールなどをいれずTEバッファーのみのほうがよいでしょうか？それともバッファーを入れるのと同時にリゾチームをいれるべきでしょうか？ 　この事に関して何か助言がありましたらぜひお願いします。

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