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(無題) 削除/引用 No.541-7 - 2007/11/26 (月) 08:49:48 - おお >[Re:6] う〜んとさんは書きました : > RocheのUPLでも対応しようとしているようです。 > ご参考まで。 ありがとうございました。よりきめ細かい設定にも対応しようとしているのですね。 ありがとうございます。 >[Re:5] 通りすがりさんは書きました : > 非放射性ラベルとして、ビオチンとDIGがあります。 > > 直接蛍光標識するより感度はよいと思われます。 > また、シグナル増幅キットも出ているので使い勝手がよいです。 ありがとうございました、NoneRIで最初に知ったこの手のキットはたしかDIGのロッシュのやつでした。やはり蛍光ではなかなか感度が追いつかない見たいですね。

(無題) 削除/引用 No.541-6 - 2007/11/25 (日) 17:26:32 - う〜んと おおさん、いつも勉強させていただいています。 さて、 サンプルの数と出るバンドの数にもよりますが、イントロンジャンクションを跨ぐ形でTaqManプローブQPCR系を組むのが、定量目的であればいいように思います。 既製品のプローブを跨がせられなくても、プライマーを跨がせられればいいと思いますが．．．．組んでおられる系はちょっと違うようですね。 RocheのUPLでも対応しようとしているようです。 ご参考まで。 http://appliedscience.custhelp.com/cgi-bin/appliedscience.cfg/php/enduser/std_adp.php?p_sid=SeEQsrvi&p_lva=2335&p_faqid=2338

非放射性ラベル 削除/引用 No.541-5 - 2007/11/23 (金) 13:24:16 - 通りすがり 非放射性ラベルとして、ビオチンとDIGがあります。 Rocheのカタログを見れば二つとも出ていると思います。 実際スレ主さんのようにPCRで検出するのに使用したわけではありませんが、in situ hybridizationのプローブを作ってみた感じだと、直接蛍光標識するより感度はよいと思われます。 また、シグナル増幅キットも出ているので使い勝手がよいです。

(無題) 削除/引用 No.541-4 - 2007/11/23 (金) 05:12:54 - おお 皆さんありがとうございます。 実は現在のラボで32PdCTPを用いてスプライシングのバリアントをPCRで検出しフォスフォイメージャーで定量しています。で32PdCTPのコスト、トラブルを考えると潮時と考えNoneRIにshiftすることを考えています。いろんな人がいる中で私の好みだけては変えられないので幅広く方法を提示した方がと思っています。そこでまず思いついたのが末端ラベルプライマーでした。 PCRご蛍光色素(エチブロなど)で染めればいいとあとになって思いましたが、アンビヨンのサイトではエチブロに否定的です。ダイナミックレンジが狭すぎるということです。 http://www.ambion.com/jp/techlib/basics/rtpcr/ http://www.ambion.com/jp/techlib/presentations/RT-PCR.pdf では他の蛍光色素はどれくらいの感度で32PdCTPと比べるとどうかなんて資料が欲しくなってきます。 そう考えると末端蛍光ラベルは末端にだけ蛍光が入るわけですから論外ですよね。それともFICTとかの蛍光強度はそのデメリットを解消するほど強いとかあるんでしょうか。 そのほか思いつくのは32PdCTPの代わりの蛍光色素dNTPを取り込ませるほうほうです。これはプローブ作成で使われているようですが、直でプロダクト検出の可能性もあるのかなとか実例が見つからないかとか思ってます。またこのようなプローブは検出感度はどうなんだろうと考えています。 >Taqmanじゃだめですか？ これも候補です。特定のエクソンを見たりということなので、すでに設計されているプローブが使えない場合がありますよね。そういうセットアップにどれぐらい時間金がいるかというのがちょっと知りたいところです。たしかキアーゲンが設計したものを売ってましたっけ、、、 あとはNoneRIRNAプロテクションアッセイがいいかなと思ってます。これはビオチンラベルでブロットしてAPとかでの検出のキットを見たことがあるようなきがしますが、今でもそれが主流でしょうか?蛍光ラベルプローブでそのまま検出とかできないかとか思います。 ま、PCRプロダクトをトランスファーして蛍光ラベル色素やビオチンを介してハイブリし検出も考えられます。少し思うのはステップを増やしたくないというのもあるわけです。初心者にやらせるにはチェックポイントが増えますし、教えるのも大変ですから。 なにかお気づきの点がありましたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.541-3 - 2007/11/22 (木) 17:04:31 - ~ 泳動して検出するのでしたら、半定量PCRじゃだめですか？ 蛍光で検出したいのでしたら、サイバーグリーン等で染色することが出来ます。 プライマーに標識するにしても、せいぜい両側のプライマーに異なる蛍光をつけて、両方で光るバンドを検出するくらいですよね？

Taqman 削除/引用 No.541-2 - 2007/11/22 (木) 13:33:45 - Amp Taqmanじゃだめですか？

プライマーにフルオレッセントダイ 削除/引用 No.541-1 - 2007/11/22 (木) 08:03:06 - おお プライマーにフルオレッセントダイをつけた状態でPCRして電気エイどうしフラグメントを定量するような方法とか詳しく述べられた物を知りませんか? ちなみにリアルタイムは複数のバンドがでるので使えません。

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