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(無題) 削除/引用 No.536-7 - 2007/11/26 (月) 11:29:53 - つん CHYさま 貴重な情報をありがとうございます。 時間に余裕のあるときに、一度試してみたいと思いました。

(無題) 削除/引用 No.536-6 - 2007/11/25 (日) 17:14:47 - CHY 確立した手法ではないのですが、１次抗体の防腐剤として使う事のあるアジ化ナトリウム(NaN3)がHRPの阻害剤として働くので、２番目の１次抗体溶液中に0.05-0.1%アジ化ナトリウムを添加することで、最初のdetection 由来のHRP活性を潰しています。 ただ、最初のdetection での２次抗体が membrane上に残るので、１次抗体にgoat IgGを使う場合は注意が必要です（多くの２次抗体は goat IgGだと思いますので）。 この方法で３種類までは順々にシグナルを検出した事があります。

(無題) 削除/引用 No.536-5 - 2007/11/22 (木) 11:23:01 - 初心者 みなさま、ご返答いただきましてありがとうございます。 メンブレンを分子量に応じてカットするというのはとてもいい方法だと思います。 以前に何度かやったことがあります。 しかし問題があって、今の上司は一度使用したメンブレンを保存しておき、しばらく経ってから『あのときのメンブレンでこのタンパクの発現も見てみてよー』とかなんとか言ってくるので、やたらにカットすることが出来ません。苦笑 複数の一次抗体を同時に反応する方法は、条件次第では可能なんですね。 今度試してみます。 ストリッピングは3-4回を限度に、そしてストリッピングしたメンブレンの結果は参考程度にとどめておこうと思います。 勉強になりました、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.536-4 - 2007/11/21 (水) 13:46:10 - Ｔ > また、複数の一次抗体を同時に反応させるという方法は可能でしょうか？ 可能ですが、実際にはメンブレンを分子量に応じて切り分けて、それぞれ別々に抗体反応しています。これならややこしい cross-reactivity などを考慮せずに済みます。対象蛋白の分子量が近接していれば難しいですが。

(無題) 削除/引用 No.536-3 - 2007/11/21 (水) 13:14:34 - う〜んと >また、複数の一次抗体を同時に反応させるという方法は可能でしょうか？ >同時にできたら時間も短縮できると思うですがどうでしょうか？ 抗体の特異性が完璧で、PAGE上の移動度が離れていれば問題ないですよ。 実際にやってました。 ストリッピングは抗原や抗体によっては全くできないこともあるし、膜上の抗原も少なからず剥がれていくので定量的なことはあまりいえないと思うし、個人的には便法としてそういうのもあるくらいのつもりでいます。

(無題) 削除/引用 No.536-2 - 2007/11/21 (水) 13:13:04 - 小児科医師（ゆとり教育） 私はヒト腎細胞の細胞質タンパクの発現を見ています。私の場合は 4回くらいストリッピングするとかなりバックグラウンドの発光が 強くなって見にくくなってきます。 複数の抗体を使用するということに関しては、 ・一次抗体（A）と一次抗体（B)が結合しない ・二次抗体（A）と二次抗体（B)が結合しない、または 　二次抗体（A）と二次抗体（B)が共通 ・一次抗体と二次抗体が交差反応しない といった条件が確定しているならば可能ではないでしょうか。 またアクチンを染めた場合、その結合力が強いためストリッピング しても抗体が十分落ちない可能性もあります。

WB　一枚のメンブレンで複数のタンパク発現を見たいとき 削除/引用 No.536-1 - 2007/11/21 (水) 12:47:20 - 初心者 ウェスタンブロットに関しましてお伺いしたいことがあります。 同じサンプルで複数のタンパク質の発現をみたい場合、ひとつずつ検出していくとストリッピングの回数が増えメンブレンに保持されているタンパク質の量に影響が出そうな気がするのですが、検出して抗体を剥がしてまた検出して・・・という操作は何回くらいまでできるのでしょうか？ （もちろん条件によって様々だとは思うのですが、目安として） また、複数の一次抗体を同時に反応させるという方法は可能でしょうか？ 同時にできたら時間も短縮できると思うですがどうでしょうか？ コメントよろしくお願いいたします。

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