全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.53-5 - 2007/08/12 (日) 14:17:34 - ~ >トランスフォームの効率が急に落ちるものなのでしょうか？ トランスフォームの効率ではなく、 大腸菌中のコピー数の話です。 pLenti6/V5-DESTをカラムで精製するときには、ローコピーのために菌体量を増やすとごみが混入するためか、 収量がとても低いときがありました。 そのため、カラム精製の始めに1mL程度でミニプレップしてプラスミド量を調べておくことにより、 (数百mL〜数Lを遠心して回収している間に泳動まで出来ると思います) カラムのせいなのか、もともとのプラスミド量が少ないのかが分かります。 それで1mL当たりのプラスミド量が全然無いのであれば、 #2の方の書いているような対策をとることになると思います。

(無題) 削除/引用 No.53-4 - 2007/08/12 (日) 12:08:53 - あなぐま お二方ともありがとうございます．ご教示いただいたInvitrogenのウェブではStble2よりStbl3の方がいいようですね．Stbl3にはendA活性があるので，プラスミドが得られないとどうしても不安になってStbl3を避けて，Stbl2を使っていました． Invitrogenのテクニカルサポートに尋ねたときには，Stbl3にトランスフォームして，アンピシリンの濃度は50 ug/mlに下げ，30度で培養してみるといいかもしれないとの回答でした．これをStbl2でやってみて失敗したのですが，Stbl3でもトライしてみることにします． コピー数の低さですが，GFPや自分のプロジェクトに使う蛋白のDNAが入った同じベクター（大きさは9kb程）では，問題なくプラスミドがとれます．lacZのベクターは11kbですが，このあたりの大きさになるとトランスフォームの効率が急に落ちるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.53-3 - 2007/08/12 (日) 11:33:53 - ~ コピー数が少ないので、ロスっていませんか？ カラムにかける前に1mL位をアルカリSDS法で回収して、 収率を見てみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.53-2 - 2007/08/12 (日) 11:18:25 - Ｔ ３０℃で培養したり、液体培養でなくプレート上に生えたコロニーを掻き取って使用したりという対処法が有効な場合があります。 ただ、普通に培養しても Stbl3 なら一応大丈夫という報告はあるようですが。 http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/c7373001.pdf

形質転換のなぞ 削除/引用 No.53-1 - 2007/08/12 (日) 06:42:00 - あなぐま pLenti6.2/V5/lacZというInvitrogenのベクター（11 kb) を大腸菌にトランスフォームしています。コロニーをとってきてLBで増やし、QiagenまたはPromegaのキットでプラスミドを精製しアガロースゲルで泳動してみてもなんのバンドも見られません。このベクターはampicillinとblasticidin両方の薬剤体制遺伝子を持っているので、どちらかの薬剤、または両方を使って培養していますが、大腸菌は増えるのに、プラスミドはとれないのです。どういうことなのでしょうか？ 使った大腸菌はStbl2とStbl3です。どちらもうまくいきません。 ちなみに、pLenti6.2/EmGFPというよく似たベクターは問題なく増やすことができました。lacZにはなにかトリックがあるのではないかと疑ってしまいます。この三ヶ月ほどここで実験が滞ってしまっています。なにかよい助言をいただけますでしょうか。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---