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レトロウィルスベースのcDNAライブラリーについて。 トピック削除
No.519-TOPIC - 2007/11/19 (月) 17:46:33 - ９６A
レトロウィルスベースのcDNAライブラリーを構築しようと考えております。

いくつかのグループの論文を見ましたが、どれも作成法として次のように書いてあります。

↓オリゴTカラムでmRNA（ポリAをもつRNAを単離）
↓オリゴTプライマーで逆転写
↓5’末端にリンカーをつける
↓制限酵素で切断しレトロウィルスベクターにLTRに対し順方向で入れる

この手法だと、どう考えてもmRNAにあるポリA転化シグナルが3'LTRの前に入ると思います。パッケージングの際にその位置でポリA転化が始まってしまうと、3'LTRの直前に位置するPPT（ポリプリントラクト）まで転写されず、感染細胞で逆転写ができないと思うのですが、どうなんでしょうか？

詳しい方、また実際にこのような実験を行った方がいましたらぜひ教えてください。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.519-4 - 2007/11/22 (木) 13:40:09 - ９６A
RETROさん、atsさん、レスありがとうございます。

ポリA付加にはポリAシグナルより下流の配列も必要なんですね。
THE CELLにも書いてありました。
納得です。

(無題) 削除/引用
No.519-3 - 2007/11/21 (水) 19:41:06 - ats
polyA付加には、切断部位（polyA付加部位）後の配列も重要です。
論文も複数あると思います。
mRNAから逆転写した配列では、その部分がpolyTに置き換わっているから、RETROさんの言う通りread-throughするのでしょう。

(無題) 削除/引用
No.519-2 - 2007/11/19 (月) 19:31:43 - RETRO
レトロcDNAライブラリーを用いた発現クローニングの経験者ですが、問題なくcDNAが発現されてきます。おそらくread throughしてしまうのだと思います。もちろん発現クローニングの場合、発現するものしか拾えてこないので、当たり前といえば当たり前ですが。

レトロウィルスベースのcDNAライブラリーについて。 削除/引用
No.519-1 - 2007/11/19 (月) 17:46:33 - ９６A
レトロウィルスベースのcDNAライブラリーを構築しようと考えております。

いくつかのグループの論文を見ましたが、どれも作成法として次のように書いてあります。

↓オリゴTカラムでmRNA（ポリAをもつRNAを単離）
↓オリゴTプライマーで逆転写
↓5’末端にリンカーをつける
↓制限酵素で切断しレトロウィルスベクターにLTRに対し順方向で入れる

この手法だと、どう考えてもmRNAにあるポリA転化シグナルが3'LTRの前に入ると思います。パッケージングの際にその位置でポリA転化が始まってしまうと、3'LTRの直前に位置するPPT（ポリプリントラクト）まで転写されず、感染細胞で逆転写ができないと思うのですが、どうなんでしょうか？

詳しい方、また実際にこのような実験を行った方がいましたらぜひ教えてください。
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