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確かに。。。 削除/引用 No.502-7 - 2007/12/03 (月) 15:36:10 - daikin おお様、~様のおっしゃるとおり、今回の一番の問題はバッファーのpHではなく、DNA量とリン酸やカルシウムの比が問題だったようです。 先日、入れるDNA量とバッファーのリン酸濃度を様々に変えて実験してみたところ、一番いい結果を出したものでは目標の40％に近いトランスフェクション効率が得られました。 ちなみに、そのとき各条件につきHEPESとBESでそれぞれバッファーを変えてトランスフェクションを行ってみたのですが、BESでバッファーを作った方が明らかにトランスフェクション効率が良かったので、私にはBESの方が合っているように思いました。 これでやっと次のステップに進めます！ みなさん本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.502-6 - 2007/11/20 (火) 07:44:50 - おお 若干アルカリよりがベターだったように思えます。 まずpHメータはどれだけ正確ですか?大抵のはかりは最後のケタは信用できませんし、スタンダードがどこまでぶれるかなどいろんなことを考慮に入れて考えるべきと思いませんか? あなたがそういう意味でpHをちょっとずつ振って確かめたのはそういう意味ではよいことだと思います。それでどれも効率が同じぐらいなら、そのpH領域であまり大きなさがないか、ほかのファクターが大きな要因でpHによるさが見られないように思えます。 もう少し総合的に見てみてはどうでしょうか。

早速のご返信ありがとうございます！ 削除/引用 No.502-5 - 2007/11/19 (月) 18:42:56 - daikin 寄せていただいたメッセージを参考に、只今色々なプロトコールをもとに主にHBSのpHの検討を行っているところです。そこでさらに質問なのですが、ＨＢＳのpHは低め（7.00以下）と高め（7.00以上）のどちらのほうが上手くいきやすいでしょうか？以前上手くいっていたときはpH7.15くらいが一番成績がよかったのですが。。。経験則に基づくことでも結構ですので、どなたか熟練されている方ご教示ください。あと、あつかましいかもしれませんが、このプロトコールなら初心者でも大丈夫というようなものが載っているサイト等ご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.502-4 - 2007/11/17 (土) 02:07:33 - おお HEPESでいいんではないかと思います。BESはトランスフェクションのときのインキュベーターの状態で大きく効率が変わります。オリジナルの方法は34-5度(だったと思う)3%CO2でインキュベートとなっています。 どちらもコンでションがよければHEKなら100%に近い導入効率が得られます(GFPのコトランスフェクションで)。モレキュラークローニングにはBESはステイブルトランズフォーマントの効率を挙げると書いてあったと思います。HEPESの場合はpHもそこそこ大事ですがそれよりDNAとカルシウムの比とかの方が重要な気がしますので、少しそのへんを考慮されてほうがいいかもしれません。 プラスミドはやはりクオリティーを一定に保つためにトランスフェクションように販売されているキットを使う方がいいように思えます。

(無題) 削除/引用 No.502-3 - 2007/11/17 (土) 00:39:32 - ~ HEPESを使用しているプロトコルの原著が1987年以降に報告されているものであれば、Chen-Okayama法よりも優れていることが期待されます。 pH以外の検討について全く書かれていないので、 トランスフェクション効率が低いのが、バッファーの種類とpHが問題かどうかは質問文からはわかりません。 バッファーの種類、pH以外に、ベクターの精製度、ベクターの量、トランスフェクション処理時間、インキュベート温度、CO2濃度、導入する細胞のロットなどに検討の余地があるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.502-2 - 2007/11/16 (金) 22:38:51 - tak pHメーターにより誤差があるので実数にはあまり意味がないかもしれませんが、 僕はHBSで6.75-6.95くらいを0.02刻みで条件を振ってます。 293cellなら80%以上は（上手くいけば100%近く）入ると思います。 CaCl2との相性もあるのでなかなか難しいとこです。

リン酸カルシウム法のBESとHEPESの違い 削除/引用 No.502-1 - 2007/11/16 (金) 17:03:03 - daikin リン酸カルシウム法でHEKにトランスフェクションをしています。 プロトコールを見るとバッファーがHEPESで作成されているものとBESが使われているものとありますがどちらがよいのでしょう？目標はトランスフェクション効率40％以上です。 現在HEPESで２×HBSをPH6.95から7.20を0.05刻みで作成して試していますが効率がいまいちです。 どなたか熟知している方ご教示下さい。

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