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(無題) 削除/引用 No.499-12 - 2007/11/17 (土) 06:26:17 - 変異 >指摘されている量を増やしてサイクル数を減らす おおさん、ありがとうございます。原理の理解の仕方で対処が全く逆になってしまうのは面白いですね。おっしゃるご示唆よくわかりました。

(無題) 削除/引用 No.499-11 - 2007/11/17 (土) 01:41:31 - おお > > 確かに、そうですね。なぜかプライマーを乗り越えるような気がしていたものですから。この辺、１００％止まるのでしょうか？　 難しいですね。でもPCR反応じゃないとして変異が入るのはちょっとPFUのフィデリティーから考えてすこし不思議な話のようなきがします。伸長反応の長さを少し短めに持っていくのもてかもしれませんが、短い産物ができる可能せいも出てくるでしょうし、フィルインで対処できるかも分かりませんからね。同じような方法でテンプレイトの量を増やしておいて普通のポリメラーぜで一回の反応でやる方法があったと思いますので、指摘されている量を増やしてサイクル数を減らすのはてかもしれませんね。 解決方法になってないのですが、一応ワークしているシステムをあまりいじるより、クローンしてミューテションのはいっている部分は ほかのクローンで補う(制限酵素を使ってキメラを作る)のが無難だと思います。

(無題) 削除/引用 No.499-10 - 2007/11/17 (土) 00:13:35 - 変異 >くるっと回ってきたストランドは、プライマーにぶつかって止まりますよね？ 確かに、そうですね。なぜかプライマーを乗り越えるような気がしていたものですから。この辺、１００％止まるのでしょうか？　それとも定量的な問題になるのでしょうか。定量的な問題となると簡単に片付かないような気もします。（例の図はあくまで理想的な場合のみを例示していると考えています。）

(無題) 削除/引用 No.499-9 - 2007/11/16 (金) 22:52:14 - う〜んと くるっと回ってきたストランドは、プライマーにぶつかって止まりますよね？ カウンタープライマーはアニールしても端っこだから伸びないでしょ？

(無題) 削除/引用 No.499-8 - 2007/11/16 (金) 22:31:55 - 変異 お話が伝わっていないような気がします。言い方を変えると当該産物にプライマーがアニールしない理由がないような気がするということです。

(無題) 削除/引用 No.499-7 - 2007/11/16 (金) 21:46:14 - う〜んと だってローリングサークルにはならないから．．．．

(無題) 削除/引用 No.499-6 - 2007/11/16 (金) 21:28:09 - 変異 FIGURE 1 Overview of the QuikChange® site-directed mutagenesis method.を見てみましたが、複製の産物が新たな鋳型にならない理由の説明にはならないと考えます。

(無題) 削除/引用 No.499-5 - 2007/11/16 (金) 20:05:17 - う〜んと >複製の産物が新たな鋳型にならない理由がよく分からないのですが、、、？ 製品添付のマニュアルのFigure.1をご覧になれば理解できると思います。 この系で変異が入るとしたら、可能性としてdNTPの枯渇が考えられるのでサイクル数か鋳型DNAを減らしてみるのもてかもしれません。 まぁ、でも大きい遺伝子だと経験上どうしても意図しない変異は入りますね。 キットのコストも高いので試行錯誤するより、たくさんクローンを拾うなどの逃げで済ましてしまいますが。 じゅうぶん大きい遺伝子なら制限酵素で切り貼りするのもありでしょう。

(無題) 削除/引用 No.499-4 - 2007/11/16 (金) 18:47:18 - 変異 ありがとうございます。 >[Re:2] 連鎖反応？さんは書きました : > オリゴヌクレオチドに含まれる領域の外の変異の話ですよね。 はい。 > > PCRと仰っていますが、QuickChangeの手法はchain reactionではありません。つまり、どのcycleでも最初に加えた鋳型が複製されるのみで、複製の産物が新たな鋳型となっていないという意味です。 PCRの語は不適切でした。複製の産物が新たな鋳型にならない理由がよく分からないのですが、、、？

(無題) 削除/引用 No.499-2 - 2007/11/16 (金) 10:26:34 - 連鎖反応？ オリゴヌクレオチドに含まれる領域の外の変異の話ですよね。領域内であれば、単にオリゴの品質の問題ですから。 PCRと仰っていますが、QuickChangeの手法はchain reactionではありません。つまり、どのcycleでも最初に加えた鋳型が複製されるのみで、複製の産物が新たな鋳型となっていないという意味です。 したがって、鋳型プラスミドを増やしても産物がそれに応じて増えるだけで、変異の頻度を下げる効果はありません。

QuikChange Site-Directed Mutagenesis と意図しない変異 削除/引用 No.499-1 - 2007/11/16 (金) 07:01:55 - 変異 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitで大きな遺伝子に変異を入れた場合、よく、意図しない部分に変異がはいることがあります。（大きければ大きいほど）　これは複製（PCR）の正確さの限界と考えておりますが、鋳型プラスミドの濃度を上げれば解決可能でしょうか？　もしやられた方がいましたらどのくらいの濃度くらいまでが適切だと思われますか？

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